تولید - محصول

اصل تست

این کیت مبتنی بر فناوری ELISA غیرمستقیم رقابتی است.چاه های میکروتیتر با آنتی ژن جفت کننده پوشانده شده اند.فلومکینباقی مانده در نمونه با آنتی ژن پوشش داده شده روی صفحه میکروتیتر برای آنتی بادی رقابت می کند.پس از افزودن آنتی بادی با برچسب آنزیمی، از بستر TMB برای نشان دادن رنگ استفاده می شود.میزان جذب نمونه با تتراسایکلین موجود در آن رابطه منفی دارد، پس از مقایسه با منحنی استاندارد، ضرب در مضرب رقت، مقدار باقیمانده فلومکین در نمونه قابل محاسبه است.

برنامه های کاربردی

از این کیت می توان در تجزیه و تحلیل کمی و کیفی باقیمانده فلومکین در عسل استفاده کرد.

واکنش های متقاطع

فلومکین…………………………………………… 100%

مواد مورد نیاز

تجهیزات

┅┅ اسپکتروفتومتر صفحه میکروتیتر (450nm/630nm)

┅┅همگن کننده یا معده ساز

┅┅شکر

┅┅میکسر گرداب

┅┅سانتریفیوژ

┅┅ تعادل تحلیلی (القایی: 0.01 گرم)

┅┅پیپت مدرج: 15 میلی لیتر

┅┅لامپ پیپت لاستیکی

┅┅لوله سانتریفیوژ پلی استایرن: 15 میلی لیتر، 50 میلی لیتر

┅┅ لوله آزمایش شیشه ای: 10 میلی لیتر

┅┅ میکروپیپت ها: 20-200 میلی لیتر، 100 میلی لیتر - 10000 میلی لیتر،

250 میلی لیتر - مولتی پیپت

معرف ها

┅┅n-هگزان (AR)

┅┅متیلن کلراید (AR)

┅┅استونیتریل (AR)

┅┅آب دیونیزه

-----اسید هیدروکلریک غلیظ (AR)

اجزای کیت

● پلیت میکروتیتر با 96 چاه پوشیده شده با آنتی ژن

● محلول های استاندارد (6 بطری × 1 میلی لیتر / بطری)

0ppb، 0.3ppb، 1.2ppb، 4.8ppb، 19.2ppb، 76.8ppb

● کنترل استاندارد غلظت بالا: (1 میلی لیتر / بطری)

………………………………………………….100ppb

● آنزیم کونژوگه 12 میلی لیتر…………………………. کلاهک قرمز

● محلول آنتی بادی 7 میلی لیتر …………..………..….….. کلاه سبز

● محلول A 7 میلی لیتر………………………………………..کلاه سفید

● محلول B 7 میلی لیتر ………………………………………… کلاه قرمز

● محلول استاپ 7 میلی لیتر…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

● محلول شستشوی غلیظ 20X 40 میلی لیتر

………………………………………………... کلاه شفاف

● محلول استخراج 2X 50 میلی لیتر……………………… کلاه آبی

آماده سازی معرف ها

7.1 نمونه عسل

محلول 1: محلول اسید هیدروکلریک 0.2 مولار

وزن 41.5 میلی لیتر اسید هیدروکلریک غلیظ، با آب یونیزه شده تا 500 میلی لیتر رقیق می شود.

راه حل 2: محلول شستشو

محلول شستشوی غلیظ را با آب دیونیزه به نسبت حجمی 1:19 رقیق کنید که برای شستشوی صفحات استفاده می شود.محلول رقیق شده را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

راه حل3: محلول استخراج

محلول استخراج غلیظ 2× را با آب دیونیزه در نسبت حجمی 1:1 (یا بسته به نیاز) رقیق کنید که برای استخراج نمونه استفاده می شود.این محلول رقیق شده را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

آماده سازی نمونه

8.1 هشدار و اقدامات احتیاطی برای کاربران قبل از عملیات

(الف) لطفاً از نکات یکباره در فرآیند آزمایش استفاده کنید و هنگام جذب معرف های مختلف، نکات را تغییر دهید.

(ب) مطمئن شوید که تمام ابزارهای آزمایشی تمیز هستند، در غیر این صورت بر نتیجه سنجش تأثیر می گذارد.

8.2نمونه عسل

-----2 گرم ± 0.05 گرم نمونه عسل را در یک لوله سانتریفیوژ پلی استایرن 50 میلی لیتری وزن کنید.

----- 2 میلی لیتر محلول اسید کلریدریک 0.2 مولار (محلول 1) اضافه کنید، ورت بزنید تا کاملا مخلوط شود، سپس 8 میلی لیتر متیلن کلراید اضافه کنید، با شیکر به مدت 5 دقیقه تکان دهید تا کاملا حل شود.

----- سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه، حداقل 3000 گرم در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد).

----- فاز رویی را بردارید، 2 میلی لیتر از محلول آلی سوبسترا را به یک لوله شیشه ای 10 میلی لیتری ببرید. بستر را در زیر حمام آب جریان نیتروژن (50-60 درجه سانتیگراد) خشک کنید.

----- 1 میلی لیتر n-هگزان، گرداب به مدت 30 ثانیه اضافه کنید، سپس 1 میلی لیتر محلول استخراج (محلول 3) اضافه کنید، دوباره به مدت 1 دقیقه ورتکس کنید.سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه، حداقل 3000 گرم در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد).

----- فاز رویی را بردارید، 50 میلی لیتر برای سنجش مصرف کنید.

9. فرآیند سنجش

9.1 قبل از سنجش توجه کنید

9.1.1 مطمئن شوید که همه معرف ها و ریز چاه ها در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) هستند.

9.1.2 تمام معرف های باقی مانده را بلافاصله پس از استفاده به 2-8 درجه سانتیگراد برگردانید.

9.1.3 شستن صحیح ریز چاه ها مرحله مهمی در فرآیند سنجش است.این عامل حیاتی برای تکرار آنالیز الایزا است.

9.1.4 از نور دوری کنید و در طول انکوباسیون ریز چاه ها را بپوشانید.

9.2 مراحل سنجش

9.2.1 همه معرف ها را در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) برای بیش از 30 دقیقه خارج کنید، قبل از استفاده همگن کنید.

9.2.2 ریز چاه های مورد نیاز را خارج کنید و بقیه را فوراً در کیسه زیپ لاک در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد برگردانید.

9.2.3 محلول شستشوی رقیق شده باید قبل از استفاده دوباره گرم شود تا در دمای اتاق باشد.

9.2.4عدد:هر موقعیت ریز چاه را شماره گذاری کنید و تمام استانداردها و نمونه ها باید به صورت تکراری اجرا شوند.استانداردها و موقعیت های نمونه را ثبت کنید.

9.2.5محلول/نمونه استاندارد را اضافه کنید:50 میکرولیتر محلول استاندارد یا نمونه آماده شده را به چاهک های مربوطه اضافه کنید.50 میکرولیتر محلول آنتی بادی اضافه کنید.با تکان دادن دستی بشقاب را به آرامی مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد با درپوش انکوبه کنید.

9.2.6شستشو:پوشش را به آرامی بردارید و مایع را از چاه ها خارج کنید و ریز چاه ها را با 250 میکرولیتر محلول شستشو رقیق شده (محلول 2) به فاصله 10 ثانیه به مدت 4 تا 5 بار شستشو دهید.آب باقیمانده را با کاغذ جاذب جذب کنید (با نوک استفاده نشده می توان بقیه حباب هوا را از بین برد).

9.2.8.مزدوج آنزیم:محلول مزدوج آنزیمی را به مقدار 100 میلی لیتر به هر چاه اضافه کنید، با تکان دادن دستی صفحه را به آرامی مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد با درب انکوبه کنید.مرحله شستشو را دوباره تکرار کنید.

9.2.8رنگ بندی:50 میکرولیتر محلول A و 50 میکرولیتر محلول B را به هر چاهک اضافه کنید.با تکان دادن دستی بشقاب را به آرامی مخلوط کنید و به مدت 15 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد با پوشش انکوبه کنید (به 12.8 مراجعه کنید).

9.2.9اندازه گرفتن:50 میکرولیتر محلول توقف را به هر چاهک اضافه کنید.با تکان دادن دستی صفحه را به آرامی مخلوط کنید و جذب را در 450 نانومتر در برابر هوای خالی اندازه گیری کنید (پیشنهاد می شود با طول موج دوگانه 450/630 نانومتر اندازه گیری کنید. نتیجه را در عرض 5 دقیقه پس از افزودن محلول توقف مطالعه کنید.) (همچنین می توانیم با دید نیز اندازه گیری کنیم. بدون راه حل توقف به طور خلاصه از ابزار ELIASA)

نتایج

10.1 درصد جذب

مقادیر میانگین مقادیر جذب به دست آمده برای استانداردها و نمونه ها بر مقدار جذب استاندارد اول (استاندارد صفر) تقسیم شده و در 100% ضرب می شود.بنابراین استاندارد صفر برابر با 100% ساخته شده و مقادیر جذب به صورت درصد ذکر شده است.

جذب (%) = B/B0 × 100%

ب - استاندارد جذب (یا نمونه)

B0 ——استاندارد جذب صفر

10.2 منحنی استاندارد

برای رسم منحنی استاندارد: مقدار جذب استانداردها را به عنوان محور y، نیمه لگاریتمی غلظت محلول استاندارد فلومکین (ppb) به عنوان محور x در نظر بگیرید.

---فلومکینغلظت هر نمونه (ppb) که از روی منحنی کالیبراسیون قابل خواندن است، در مضرب رقت مربوطه هر نمونه به دنبال آن ضرب می شود و غلظت واقعی نمونه بدست می آید.

برای کاهش داده های کیت های الایزا نرم افزار ویژه ای ساخته شده است که در صورت درخواست قابل ارائه می باشد.

11. حساسیت، دقت و دقت

حساسیت تست：0.3ppb

ضریب رقت نمونه عسل: 2

حد تشخیص

نمونه عسل ----------------------------------------------- -1ppb

دقت

نمونه عسل --------------------------------------------- 90±20 %

دقت، درستی

ضریب تغییرات کیت الایزا کمتر از 10 درصد است.

12. توجه کنید

12.1 اگر معرف ها و نمونه ها در دمای اتاق (20 تا 25 درجه سانتیگراد) تنظیم نشده باشند، میانگین مقادیر جذب به دست آمده برای استانداردها و نمونه ها کاهش می یابد.

12.2 برای جلوگیری از تکرار ناموفق اجازه ندهید ریز چاه ها بین مراحل خشک شوند و مرحله بعدی را بلافاصله پس از ضربه زدن به نگهدارنده میکرو چاه ها اجرا کنید.

12.3.هر معرف را قبل از استفاده همگن کنید.

12.4.پوست خود را از محلول استاپ دور نگه دارید زیرا 2M H است₂SO₄راه حل.

12.5 از کیت های قدیمی استفاده نکنید.معرف های دسته های مختلف را تعویض نکنید، زیرا باعث کاهش حساسیت می شود.

12.6 شرایط ذخیره سازی:

کیت های الایزا را در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگه دارید، یخ نزنید.در تمام دوره های جوجه کشی از نور مستقیم خورشید اجتناب کنید.پوشاندن صفحات میکروتیتر توصیه می شود.

12.7 نشانه هایی برای خراب شدن معرف ها:

در صورت تغییر رنگ محلول بستر باید کنار گذاشته شود.

اگر مقدار جذب (450/630nm) استاندارد صفر کمتر از 0.5 (A450nm ~ 0.5) باشد، ممکن است معرف ها خراب شوند.

12.8 واکنش رنگ آمیزی پس از افزودن محلول A و محلول B به 15 دقیقه زمان نیاز دارد. و اگر رنگ برای تعیین رنگ خیلی روشن است، می توانید محدوده زمان جوجه کشی را از 20 دقیقه به بیشتر افزایش دهید.هرگز از 25 دقیقه تجاوز نکنید، برعکس، زمان انکوباسیون را به درستی کوتاه کنید.

12.9 دمای بهینه واکنش 25 درجه سانتیگراد است.دمای بالاتر یا پایین تر منجر به تغییر مقادیر حساسیت و جذب می شود.

13. ذخیره سازی

شرایط نگهداری: 2-8 ℃.

مدت زمان نگهداری: 12 ماه.