toradh

Prionnsabal deuchainn

Tha am pasgan seo stèidhichte air teicneòlas ELISA farpaiseach neo-dhìreach.Tha na tobraichean microtiter air an còmhdach le antigen ceangail.Flumquinebidh fuigheall san sampall a’ farpais ris an antigen còmhdaichte air a’ phlàta microtiter airson an antibody.Às deidh cuir a-steach enzyme leis an ainm anti-antibody, thathas a’ cleachdadh substrate TMB gus an dath a nochdadh.Tha droch bhuaidh aig gabhail ris an t-sampall ris an tetracycline a tha a’ fuireach ann, às deidh coimeas a dhèanamh ris an Standard Curve, air iomadachadh leis an iomadachd caolachaidh, faodar meud fuigheall Flumequine san sampall a thomhas.

Iarrtasan

Faodar an uidheamachd seo a chleachdadh ann an sgrùdadh cainneachdail agus càileachdail air fuigheall flumequine ann am mil.

Tar-fhreagairt

Flumequine …………………..………………… 100%

Stuthan a dhìth

Innealan

┅┅ Spectrophotometer plàta microtiter (450nm / 630nm)

┅┅ Homogenizer no stomacher

┅ ┅ Shaker

┅┅ Measgadair Vortex

┅┅ Centrifuge

┅┅ Cothromachadh anailis (inntrigeadh: 0.01g)

┅┅ Pìob ceumnaichte: 15ml

┅┅ bulb pìobaire rubair

┅┅Polystyrene Centrifuge tube: 15ml, 50ml

┅ ┅ Tiùb deuchainn glainne: 10ml

┅ ┅ Micrippettes: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml - ioma-phìob

Ath-bheothaichean

┅┅n-heacsan(AR)

┅ ┅ cloride methylene (AR)

┅┅ Acetonitrile(AR)

┅ ┅ uisge deionized

----- searbhag hydrochloric tiugh (AR)

Co-phàirtean Kit

● Plàta microtiter le 96 tobraichean còmhdaichte le antigen

● Fuasglaidhean àbhaisteach (6 botail × 1ml / botal)

0ppb, 0.3ppb, 1.2ppb, 4.8ppb, 19.2ppb, 76.8ppb

● Smachd àbhaisteach dùmhlachd àrd: (1ml / botal)

…………………………………………………...100ppb

● Enzyme conjugate 12ml …………………………... caip dearg

● Fuasgladh antibody 7ml …………..……..….…..cap uaine

● Fuasgladh A 7ml ……..…………………..……..bonn geal

● Fuasgladh B 7ml …………….…………..………… ceap dearg

● Cuir stad air fuasgladh 7ml …………………..………caip buidhe

● 20XConcentrated nighe fuasgladh 40ml

………………………………………..…..bonn follaiseach

● 2X Fuasgladh às-tharraing 50ml ......… caip gorm

Ullachadh reactaran

7.1 Sampall mil

Fuasgladh 1 : 0.2 M Fuasgladh searbhag uisge-uisge

Cuideam 41.5ml searbhag hydrochloric tiugh, caolaich le uisge deionized gu 500 ml.

Solution 2: Nigh fuasgladh

Lùghdaich am fuasgladh nighe tiugh le uisge deionized anns a ’cho-mheas tomhas-lìonaidh 1:19, a thèid a chleachdadh airson na truinnsearan a nighe.faodar am fuasgladh caolaichte a stòradh aig 4 ℃ airson 1 mìos.

Fuasgladh3: fuasgladh às-tharraing

Lùghdaich am fuasgladh às-tharraing cuimsichte 2 × le uisge deionized anns a’ chuibhreann tomhas-lìonaidh de 1: 1 (no an urra ri riatanas), a thèid a chleachdadh airson às-tharraing sampall.Faodar am fuasgladh caolaichte seo a ghleidheadh ​​​​airson 1 mìos aig 4 ℃.

Ullachaidhean Eisimpleirean

8.1 Sanas agus rabhadh airson an luchd-cleachdaidh mus obraich iad

(a) Feuch an cleachd thu molaidhean aon-uair ann am pròiseas deuchainn, agus atharraich na molaidhean nuair a ghabhas thu a-steach diofar imoibrí.

(b) Dèan cinnteach gu bheil a h-uile inneal deuchainneach glan, air neo bheir e buaidh air toradh an assay.

8.2Sampall mil

----- Cuidich sampall meala 2g ± 0.05g a-steach do phìob centrifuge polystyrene 50ml,

----- Cuir 2ml 0.2 M fuasgladh searbhag hydrochloric (Solution 1), vortex gus a mheasgachadh gu tur, an uairsin cuir 8ml methylene chloride, crathadh le crathadh airson 5min gus a sgaoileadh gu tur;

----- Centrifuge airson 10 min, co-dhiù 3000g aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃);

----- Thoir air falbh an ìre supernatant, thoir 2 ml den fhuasgladh organach substrate gu tiùb glainne 10 ml.

----- Cuir 1 ml n-hexane, vortex airson 30s, an uairsin cuir fuasgladh às-tharraing 1ml (fuasgladh 3), vortex a-rithist airson 1min.Centrifuge airson 5min, co-dhiù 3000g aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃);

----- Thoir air falbh an ìre supernatant, gabh 50ml airson assay;

9. Pròiseas assay

9.1 Sanas ron assay

9.1.1 Dèan cinnteach gu bheil na h-ath-bheachdan agus na microwells uile aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).

9.1.2 Thoir air ais na h-ath-bheachdan eile gu 2-8 ℃ dìreach às deidh an cleachdadh.

9.1.3 Tha a bhith a’ nighe nam microwells gu ceart na cheum cudromach ann am pròiseas assay;tha e na fheart deatamach do ath-aithris mion-sgrùdadh ELISA.

9.1.4 Seachain an solas agus còmhdaich na microwells aig àm goir.

9.2 Ceumannan Assay

9.2.1 Thoir a-mach na h-uile ath-bheachdan aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson barrachd air 30min, homogenize mus tèid a chleachdadh.

9.2.2 Thoir a-mach na microwells a tha a dhìth agus till an còrr a-steach don bhaga glas-zip aig 2-8 ℃ sa bhad.

9.2.3 Bu chòir am fuasgladh nighe caolaichte a bhith air ath-bhlàthachadh gus a bhith aig teòthachd an t-seòmair mus tèid a chleachdadh.

9.2.4Àireamh:Bu chòir àireamh a h-uile suidheachadh microwell agus a h-uile inbhe agus sampall a ruith ann an dùblachadh.Clàraich na h-inbhean agus suidheachadh sampall.

9.2.5Cuir fuasgladh / sampall àbhaisteach ris:Cuir 50 µl de fhuasgladh àbhaisteach no sampall ullaichte ris na tobraichean co-fhreagarrach.Cuir a-steach fuasgladh antibody 50 µl.Meudaich gu socair le bhith a’ crathadh a’ phlàta le làimh agus goir airson 30 mionaid aig 25 ℃ le còmhdach.

9.2.6Nigh:Thoir air falbh an còmhdach gu socair agus glan an leaghan a-mach às na tobraichean agus nigh na microwells le fuasgladh nighe caolaichte 250µl (fuasgladh 2) aig eadar-ama 10s airson 4-5 tursan.Gabh a-steach an uisge a tha air fhàgail le pàipear sùghaidh (faodar am builgean èadhair eile a chuir às le tip nach deach a chleachdadh).

9.2.8.Enzyme conjugate:Cuir fuasgladh enzyme conjugate 100ml ris gach tobar, Measg gu socair le bhith a’ crathadh a ’phlàta le làimh agus goir airson 30min aig 25 ℃ le còmhdach.Dèan a-rithist an ceum nighe a-rithist.

9.2.8Dath:Cuir 50µl fuasgladh A agus 50µl fuasgladh B ri gach tobar.Meudaich gu socair le bhith a’ crathadh a’ phlàta le làimh agus goir airson 15 mionaid aig 25 ℃ le còmhdach (faic 12.8).

9.2.9Tomhais:Cuir 50 µl am fuasgladh stad ri gach tobar.Meudaich gu socair le bhith a’ crathadh a’ phlàta le làimh agus tomhais an sùghadh aig 450nm an aghaidh èadhar bàn (Thathas a’ moladh tomhas leis an tonn-dùbailte 450/630nm. Leugh an toradh taobh a-staigh 5min às deidh fuasgladh stad a chur ris. ) (Faodaidh sinn cuideachd tomhas le sealladh fuasgladh gun stad ann an ùine ghoirid an ionnstramaid ELIASA)

Toraidhean

10.1 sa cheud sùghaidh

Tha luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan air an roinn le luach sùghaidh a’ chiad ìre (inbhe neoni) agus air an iomadachadh le 100%.Mar sin tha an ìre neoni air a dhèanamh co-ionann ri 100% agus tha na luachan sùghaidh air an ainmeachadh ann an ceudadan.

Neo-làthaireachd (%) = B/B0 × 100%

B —— inbhe neo-làthaireachd (no sampall)

B0 —— inbhe neoni

10.2 Curve àbhaisteach

Gus lùb àbhaisteach a tharraing: Gabh luach sùghadh inbhean mar y-axis, leth-logarithmic de chruinneachadh an fhuasglaidh inbhean flumequine (ppb) mar x-axis.

--- Tha anflumequinetha dùmhlachd de gach sampall (ppb), a ghabhas leughadh bhon lùb calibration, air iomadachadh leis an iomadachd caolachaidh co-fhreagarrach de gach sampall a thèid a leantainn, agus gheibhear an fhìor chruinneachadh de shampall.

Airson lughdachadh dàta de na goireasan ELISA, chaidh bathar-bog sònraichte a leasachadh, a dh’ fhaodar a thoirt seachad ma thèid iarraidh.

11. Cugallachd, mionaideachd agus mionaideachd

Mothachadh deuchainn:0.3ppb

Factar caolachaidh mil sampall: 2

Crìochan lorgaidh

Sampall meala ---------------------------------------------- -1 ppb

Cruinneas

Sampall meala --------------------------------------------- 90 ±20 %

Cruinneas

Tha co-èifeachd eadar-dhealachaidh an uidheamachd ELISA nas lugha na 10%.

12. Sanas

12.1 Thèid luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan a lughdachadh mura h-eil na h-ath-bheachdan agus na sampallan air an riaghladh gu teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).

12.2 Na leig le microwells tiormachadh eadar ceumannan gus ath-aithris neo-shoirbheachail a sheachnadh agus obraich an ath cheum sa bhad às deidh dha tapadh air neach-gleidhidh microwells.

12.3.Homogenize gach reagent mus cleachd thu e.

12.4.Cùm do chraiceann air falbh bhon fhuasgladh stad oir is e an 2M H₂SO₄fuasgladh.

12.5 Na cleachd na goireasan as ùire.Na atharraich na h-ath-bheachdan de dhiofar bhaidsean, oir leigidh e sìos an cugallachd.

12.6 Suidheachadh stòraidh:

Cùm na goireasan ELISA aig 2-8 ℃, na reothadh.Plataichean microwell fois ròin Seachain solas dìreach rè gach goir.Thathas a 'moladh a bhith a' còmhdach nam plèanaichean microtiter.

12.7 Comharraidhean airson na h-ath-bheachdan a’ dol dona:

Bu chòir fuasgladh substrate a thrèigsinn ma thionndaidheas e dathan.

Faodaidh na h-ath-bheachdan tionndadh dona ma tha an luach sùghaidh (450/630nm) den inbhe neoni nas ìsle na 0.5 (A450nm ＜0.5).

12.8 Feumaidh an ath-bhualadh dath 15min às deidh Fuasgladh A agus Fuasgladh B a chuir ris. Agus faodaidh tu an ùine brosnachaidh a leudachadh bho 20 mionaid gu barrachd ma tha an dath ro aotrom airson a dhearbhadh.Na bi a-riamh nas fhaide na 25min, Air an làimh eile, giorraich an ùine goir gu ceart.

12.9 Is e an teòthachd ath-bhualadh as fheàrr 25 ℃.Bidh teòthachd nas àirde no nas ìsle a’ leantainn gu atharrachaidhean ann an luachan cugallachd agus sùghaidh.

13. Stòradh

Suidheachadh stòraidh: 2-8 ℃.

Ùine stòraidh: 12 mìosan.