Konkurrerende enzymimmunoassay-sett for kvantitativ analyse av tylosin
Konkurransedyktig enzymimmunoassay-sett for
Kvantitativ analyse avTylosin
1. Bakgrunn
Tylosiner et makrolidantibiotikum, som hovedsakelig brukes som antibakteriell og antimykoplasma.Det er etablert strenge MRLer siden dette stoffet kan føre til alvorlige bivirkninger i visse grupper.
Dette settet er et nytt produkt basert på ELISA-teknologi, som er raskt, enkelt, nøyaktig og følsomt sammenlignet med vanlig instrumentell analyse og kun trenger 1,5 time i en operasjon, det kan betraktelig minimere driftsfeil og arbeidsintensitet.
2. Testprinsipp
Dette settet er basert på indirekte konkurrerende ELISA-teknologi.Mikrotiterbrønnene er belagt med koblingsantigen.Tylosinrester i prøven konkurrerer med antigenet som er belagt på mikrotiterplaten om antistoffet.Etter tilsetning av enzymmerket anti-antistoff, brukes TMB-substrat for å vise fargen.Absorbansen til prøven er negativt relatert til tylosinet i den, etter sammenligning med standardkurven, multiplisert med fortynningsfaktoren, kan tylosinrestmengden i prøven beregnes.
3. Søknader
Dette settet kan brukes i kvantitativ og kvalitativ analyse av tylosinrester i dyrevev (kylling, svinekjøtt, and) og melk, honning, egg, etc.
4. Kryssreaksjoner
Tylosin………………………………………………………..100 %
Tilmicosin………………………………………………………<2 %
5. Materialer som kreves
5.1 Utstyr:
---- Mikrotiterplatespektrofotometer (450nm/630nm)
---- Roterende fordamper eller nitrogentørkeinstrumenter
----homogenisator
----Shaker
---- Sentrifuger
----Analytisk balanse (induktans: 0,01g)
---- Gradert pipette: 10ml
----Gummipipettepære
----Volumetrisk kolbe: 10ml
----Polystyren sentrifugerør: 50ml
----Mikropipetter: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml multipipette
5.2 Reagenser:
----Natriumhydroksid (NaOH, AR)
---- Natriumbikarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natriumkarbonat (NaCO3, AR)
----Trikloreddiksyre (AR)
---- Acetonitril (AR)
---- Etylacetat (AR)
┅┅n-heksan (AR)
----Avionisert vann
6. Kitkomponenter
l Mikrotiterplate med 96 brønner belagt med antigen
l Standardløsninger (5 flasker, 1 ml/flaske)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standard kontroll: (1ml/flaske)1 ppm
l Enzymkonjugat 1ml…………………..…..…rød hette
l Antistoffløsning 7ml……………….…………grønn hette
l Løsning A 7ml………………………….….……hvit hette
l Løsning B 7ml…………………………………..rød kork
l Stoppløsning 7ml.……………….……….gul kork
l 20×konsentrert vaskeløsning 40ml
…………………………………..…gjennomsiktig hette
l 4×konsentrert ekstraksjonsløsning 50ml
……………………………………………….blå hette
7. Klargjøring av reagenser:
Løsning 1:0,1 mol/L NaOH-løsning
Vei 0,4 g NaOH til 100 ml avionisert vann og bland fullstendig.
Løsning 2: 1mol/L NaOH-løsning
Vei 4 g NaOH til 100 ml avionisert vann og bland fullstendig.
Løsning 3: Karbonatbuffersalt
Løsning1: 0,2M PB
Løs opp 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O med avionisert vann og fortynn til 1000ml.
Løsning2: Ekstraksjonsløsning
Fortynn den 2×konsentrerte ekstraksjonsløsningen med avionisert vann i volumforholdet 1:1(f.eks. 10ml 2×ekstraksjonsløsning + 10ml avionisert vann), som vil bli brukt til prøveekstraksjon,denne løsningen kan lagres ved 4 ℃ i 1 måned.
Løsning3: Vaskeløsning
Fortynn den 20×konsentrerte vaskeløsningen med avionisert vann i volumforholdet 1:19(f.eks. 5ml 20×vaskeløsning + 95ml avionisert vann), som skal brukes til å vaske platene.Denne løsningen kan lagres ved 4 ℃ i 1 måned.
8. Prøveforberedelser
8.1 Merknad og forholdsregler før bruk:
(a) Vennligst bruk engangsspisser under eksperimentet, og bytt spissene når du absorberer forskjellige reagenser.
(b) Sørg for at alle instrumenter er rene.
(c) Hold vevsprøven i fryseren.
(d) Forberedt prøve bør brukes til analyse med en gang.
8.2 Dyrevev (kylling, svinekjøtt osv.)
---- Homogeniser prøven med homogenisator;
----Ta 2,0±0,05 g homogenat inn i et 50 ml polystyren sentrifugerør;tilsett 2ml 0,2M PB (løsning1), rist for å oppløses, og tilsett deretter 8 ml etylacetat og rist kraftig i 3 minutter;
---- Sentrifuge for separasjon: 3000g / omgivelsestemperatur / 5min.
---- Overfør 4 ml av supernatantens organiske fase til et 10 ml glassrør, tørk med 50-60 ℃ vannbad under nitrogengassstrøm;
---- Løs opp den tørre resten med 1 ml n-heksan, vortex i 30 sekunder for å oppløses, og tilsett deretter 1 ml ekstraksjonsløsning (løsning2), vortex i 1 min.sentrifuge for separering: 3000g / omgivelsestemperatur / 5min
---- Fjern supernatanten n-heksanfase;ta 50 μl av substratets vandige fase for analyse.
Fortynningsfaktor: 1
8.2 Melk
----Ta 100 μl råmelkprøve, bland med 900 μl ekstraksjonsløsning (løsning2), og bland helt.
----Ta 50 μl av den forberedte løsningen for analyse.
Fortynningsfaktor: 10
9. Analyseprosess
9.1 Merknad før analyse
9.1.1Sørg for at alle reagenser og mikrobrønner har romtemperatur (20-25 ℃).
9.1.2Sett alle de resterende reagensene tilbake til 2-8℃umiddelbart etter bruk.
9.1.3Å vaske mikrobrønnene riktig er et viktig trinn i prosessen med analysen;det er den avgjørende faktoren for reproduserbarheten av ELISA-analysen.
9.1.4 Atøm lyset og dekk til mikrobrønnene under inkubasjonen.
9.2 Analysetrinn
9.2.1 Ta ut alle reagenser ved romtemperatur (20-25 ℃) i mer enn 30 minutter, rist forsiktig før bruk.
9.2.2 Få ut de nødvendige mikrobrønnene og legg resten tilbake i zip-lock-posen ved 2-8 ℃ umiddelbart.
9.2.3 Den fortynnede vaskeløsningen bør varmes opp igjen til romtemperatur før bruk.
9.2.4Antall:Nummerert hver mikrobrønnposisjon og alle standarder og prøver skal kjøres i duplikat.Registrer standardene og prøveposisjonene.
9.2.5Add standardløsning/prøve og antistoffløsning: Tilsett 50 µl standardløsning ((sett medfølger)) eller forberedt prøve til tilsvarende brønner.Tilsett 50 µl antistoffløsning (sett medfølger).Bland forsiktig ved å riste platen manuelt og inkuber i 30 minutter ved 37 ℃ med lokk.
9.2.6Vask: Fjern dekselet forsiktig og rens væsken ut av brønnene og skyll mikrobrønnene med 250 µl fortynnet vaskeløsning (løsning3) med intervaller på 10 sekunder i 4-5 ganger.Absorber gjenværende vann med absorberende papir (resten luftboble kan elimineres med ubrukt spiss).
9.2.7Tilsett enzymkonjugat: Tilsett 100 ml enzymkonjugatløsning (sett medfølger) til hver brønn, bland forsiktig og inkuber i 30 minutter ved 37 ℃ med lokk.Gjenta vasketrinnet igjen.
9.2.8Farging: Tilsett 50 µl av løsning A(sett medfølger) og 50 µl løsning B(sett medfølger) til hver brønn.Bland forsiktig og inkuber i 15 minutter ved 37 ℃ med lokk.
9.2.9Måle: Tilsett 50 µl av stoppløsningen (sett medfølger) til hver brønn.Bland forsiktig og mål absorbansen ved 450 nm (det er foreslått mål med dobbel bølgelengde på 450/630 nm. Les resultatet innen 5 minutter etter tilsetning av stoppløsning).
10. Resultater
10.1 Prosentvis absorbans
Gjennomsnittsverdiene for absorbansverdiene oppnådd for standardene og prøvene er delt på absorbansverdien til den første standarden (nullstandard) og multiplisert med 100 %.Nullstandarden er dermed lik 100 % og absorbansverdiene er oppgitt i prosent.
B
Absorbans (%) = —— ×100 %
B0
B ——absorbansstandard (eller prøve)
B0 ——absorbans null standard
10.2 Standardkurve
---- For å tegne en standardkurve: Ta absorbansverdien til standarder som y-akse, semilogaritmisk av konsentrasjonen av tylosinstandardløsningen (ppb) som x-akse.
----Tylosinkonsentrasjonen til hver prøve (ppb), som kan avleses fra kalibreringskurven, multipliseres med den tilsvarende fortynningsfaktoren for hver prøve som følges, og den faktiske konsentrasjonen av prøven oppnås.
Vennligst legg merke til:
Det er utviklet spesiell programvare for dataanalyse, som kan leveres på forespørsel.
11. Følsomhet, nøyaktighet og presisjon
Testsensitivitet:1,5 ppb
Deteksjonsgrense:
Dyrevev……………………………….…………………1,5 ppb Melk…………………………………………………………………..15ppb Nøyaktighet:
Dyrevev………………………………………………80±15 %
Melk…………………………………………..……….……80±10 %
Presisjon:
Variasjonskoeffisienten til ELISA-settet er mindre enn 10 %.
12. Merknad
12.1 Gjennomsnittsverdiene for absorbansverdiene oppnådd for standardene og prøvene vil bli redusert dersom reagensene og prøvene ikke er regulert til romtemperatur (20-25 ℃).
12.2 Ikke la mikrobrønnene tørke mellom trinnene for å unngå mislykket reproduserbarhet, og utfør neste trinn umiddelbart etter at du har banket på mikrobrønnholderen.
12.3 Rist hver reagens forsiktig før bruk.
12.4 Hold huden unna stoppløsningen, for den er 0,5MH2SO4løsning.
12.5 Ikke bruk settene utdatert.Ikke bytt ut reagensene til forskjellige partier, ellers vil det redusere følsomheten.
12.6 Hold ELISA-settene ved 2-8 ℃, ikke frys.Forsegl hvile mikrobrønnplater, Unngå direkte sollys under alle inkubasjoner.Det anbefales å dekke til mikrotiterplatene.
12.7 Substratløsning bør forlates hvis den får farger.Reagensene kan bli dårlige hvis absorbansverdien (450/630nm) til nullstandarden er mindre enn 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Fargingsreaksjonen trenger 15 minutter etter tilsetning av løsning A og løsning B. Og du kan forlenge inkubasjonstiden til 20 minutter eller mer hvis fargen er for lys til å kunne bestemmes.Overskrid aldri 30min, tvert imot, forkort inkubasjonstiden skikkelig.
12.9 Den optimale reaksjonstemperaturen er 37 ℃.Høyere eller lavere temperatur vil føre til endringer i følsomhets- og absorbansverdier.
13. Oppbevaring
Lagringstilstand: 2-8 ℃.
Lagringstid: 12 måneder.
