Competitieve enzymimmunoassaykit voor kwantitatieve analyse van tylosine
Competitieve Enzym Immunoassay Kit voor
Kwantitatieve analyse vanTylosine
1. Achtergrond
Tylosineis een macrolide-antibioticum, dat voornamelijk wordt toegepast als antibacterieel en anti-mycoplasma.Er zijn strikte MRL's vastgesteld omdat dit middel bij bepaalde groepen tot ernstige bijwerkingen kan leiden.
Deze kit is een nieuw product op basis van ELISA-technologie, die snel, gemakkelijk, nauwkeurig en gevoelig is in vergelijking met gewone instrumentele analyse en slechts 1,5 uur nodig heeft in één bewerking, het kan bedieningsfouten en werkintensiteit aanzienlijk minimaliseren.
2. Testprincipe
Deze kit is gebaseerd op indirect-competitieve ELISA-technologie.De microtiterputjes zijn gecoat met koppelingsantigeen.Tylosineresidu in het monster concurreert met het op de microtiterplaat gecoate antigeen om het antilichaam.Na de toevoeging van enzym-gelabeld anti-antilichaam, wordt TMB-substraat gebruikt om de kleur te tonen.Absorptie van het monster is negatief gerelateerd aan de tylosine die erin zit, na vergelijking met de standaardkromme, vermenigvuldigd met de verdunningsfactor, kan de hoeveelheid tylosineresidu in het monster worden berekend.
3. Toepassingen
Deze kit kan worden gebruikt voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van tylosineresidu in dierlijk weefsel (kip, varken, eend) en melk, honing, ei, enz.
4. Kruisreacties
Tylosine………………………………………………..100%
Tilmicosine………………………………………………<2%
5. Benodigde materialen
5.1 Uitrusting:
---- Microtiter plaat spectrofotometer (450nm/630nm)
---- Instrumenten voor het drogen van roterende verdampers of stikstof
----homogenisator
----Shaker
----Centrifugeer
---- Analytische balans (inductie: 0,01 g)
----Gegradueerde pipet: 10ml
----Rubberen pipetballon
---- Maatkolf: 10 ml
----Polystyreen centrifugebuisjes: 50ml
----Micropipetten: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml multipipet
5.2 Reagentia:
----Natriumhydroxide (NaOH, AR)
---- Natriumbicarbonaat (NaHCO3,AR)
---- Natriumcarbonaat (NaCO3, AR)
----Trichloorazijnzuur (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Ethylacetaat (AR)
┅┅n-hexaan (AR)
----Gedeïoniseerd water
6. Kitcomponenten
l Microtiterplaat met 96 putjes bekleed met antigeen
l Standaardoplossingen (5 flessen, 1 ml/fles)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Spiking standaard controle: (1 ml/fles)1ppm
l Enzymconjugaat 1 ml …………… ..… .. rode dop
l Antilichaamoplossing 7ml……………….…… groene dop
l Oplossing A 7ml…………………….….……witte dop
l Oplossing B 7ml...……………………………..rode dop
l Stopoplossing 7ml.……………….……….gele dop
l 20×geconcentreerde wasoplossing 40ml
…………………………………..…transparante dop
l 4×geconcentreerde extractie-oplossing 50ml
……………………………………………….blauwe pet
7. Voorbereiding reagentia:
Oplossing 1:0,1 mol/L NaOH-oplossing
Weeg 0,4 g NaOH af op 100 ml gedeïoniseerd water en meng volledig.
Oplossing 2: 1mol/L NaOH-oplossing
Weeg 4 g NaOH af op 100 ml gedeïoniseerd water en meng volledig.
Oplossing 3: Carbonaatbufferzout
Oplossing1: 0,2 miljoen PB
Los 51,6 g Na op2HPO4·12 uur2O, 8,7 g NaH2PO4·2U2O met gedemineraliseerd water en verdunnen tot 1000 ml.
Oplossing2: Extractie-oplossing
Verdun de 2×geconcentreerde extractie-oplossing met gedeïoniseerd water in de volumeverhouding van 1:1(bijv. 10 ml 2×extractieoplossing + 10 ml gedeïoniseerd water), die zal worden gebruikt voor monsterextractie,deze oplossing kan 1 maand bij 4 ℃ worden bewaard.
Oplossing3: Wasoplossing
Verdun de 20 × geconcentreerde wasoplossing met gedeïoniseerd water in de volumeverhouding van 1:19 (bijv. 5 ml 20 × wasoplossing + 95 ml gedeïoniseerd water), die zal worden gebruikt voor het wassen van de borden.Deze oplossing kan 1 maand bij 4 ℃ worden bewaard.
8. Monstervoorbereidingen
8.1 Kennisgeving en voorzorgsmaatregelen voor gebruik:
(a) Gebruik alstublieft eenmalige tips tijdens het experiment en verander de tips wanneer u een ander reagens absorbeert.
(b) Zorg ervoor dat alle instrumenten schoon zijn.
(c) Bewaar het weefselmonster in de vriezer.
(d) Het geprepareerde monster moet onmiddellijk voor de analyse worden gebruikt.
8.2 Dierlijk weefsel (kip, varken, enz.)
----Homogeniseer het monster met homogenisator;
----Neem 2,0 ± 0,05 g homogenaat in een polystyreen centrifugebuis van 50 ml;voeg 2ml 0.2M PB toe (oplossing1) Schud om op te lossen en voeg dan 8 ml ethylacetaat toe en schud krachtig gedurende 3 minuten;
----Centrifugeer voor scheiding: 3000g / omgevingstemperatuur / 5min.
---- Breng 4 ml van de bovenstaande organische fase over in een glazen buis van 10 ml, droog met een waterbad van 50-60 ℃ onder een stikstofgasstroom;
---- Los de droge rest op met 1 ml n-hexaan, vortex gedurende 30 seconden om op te lossen en voeg dan 1 ml extractieoplossing toe (oplossing2), vortex gedurende 1 minuut.centrifuge voor scheiding: 3000g / omgevingstemperatuur / 5min
----Verwijder de bovenstaande n-hexaanfase;neem 50 μl van de substraatwaterfase voor analyse.
Verdunningsfactor: 1
8.2 Melk
----Neem 100μl rauwe melkmonster, meng met 900μl extractie-oplossing (oplossing2), en meng volledig.
---- Neem 50 μl van de bereide oplossing voor analyse.
Verdunningsfactor: 10
9. Analyseproces
9.1 Kennisgeving vóór de test
9.1.1Zorg ervoor dat alle reagentia en microwells allemaal op kamertemperatuur zijn (20-25℃).
9.1.2Breng alle overige reagentia terug naar 2-8℃direct na gebruik.
9.1.3Het correct wassen van de microwells is een belangrijke stap in het assayproces;het is de vitale factor voor de reproduceerbaarheid van de ELISA-analyse.
9.1.4 EENmaak het licht ongeldig en bedek de microwells tijdens de incubatie.
9.2 Teststappen
9.2.1 Haal alle reagentia eruit bij kamertemperatuur (20-25 ℃) gedurende meer dan 30 minuten, schud voorzichtig voor gebruik.
9.2.2 Haal de benodigde microwells eruit en doe de rest onmiddellijk terug in de zak met ritssluiting bij 2-8 ℃.
9.2.3 De verdunde wasoplossing moet vóór gebruik opnieuw worden opgewarmd tot kamertemperatuur.
9.2.4Nummer:Elke positie van de microwell moet worden genummerd en alle standaarden en monsters moeten in tweevoud worden uitgevoerd.Noteer de normen en monsterposities.
9.2.5Add standaardoplossing/monster en antilichaamoplossing: Voeg 50µl standaardoplossing toe((meegeleverde kit)) of geprepareerd monster naar overeenkomstige putjes.Voeg 50 µl antilichaamoplossing toe (meegeleverde kit).Meng voorzichtig door de plaat handmatig te schudden en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ℃ met deksel.
9.2.6Wassen: Verwijder voorzichtig het deksel en zuiver de vloeistof uit de wells en spoel de microwells met 250µl verdunde wasoplossing (oplossing3) met een interval van 10 seconden gedurende 4-5 keer.Absorbeer het resterende water met absorberend papier (de resterende luchtbel kan worden verwijderd met een ongebruikte tip).
9.2.7Voeg enzymconjugaat toe: Voeg 100 ml enzymconjugaatoplossing toe (meegeleverde kit) aan elk putje, meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ℃ met deksel.Herhaal de wasstap opnieuw.
9.2.8Kleur: Voeg 50µl oplossing A(meegeleverde kit) en 50 µl oplossing B(meegeleverde kit) naar elke put.Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ℃ met deksel.
9.2.9Meten: Voeg 50µl van de stopoplossing toe (meegeleverde kit) naar elke put.Meng voorzichtig en meet de absorptie bij 450 nm (er wordt aangeraden om te meten met de dubbele golflengte van 450/630 nm. Lees het resultaat binnen 5 minuten na het toevoegen van de stopoplossing).
10. Resultaten
10,1 Percentage absorptie
De gemiddelde waarden van de absorptiewaarden verkregen voor de standaarden en de monsters worden gedeeld door de absorptiewaarde van de eerste standaard (nulstandaard) en vermenigvuldigd met 100%.Zo wordt de nulnorm gelijk gemaakt aan 100% en worden de absorptiewaarden in procenten weergegeven.
B
Absorptie (%) = —— ×100%
B0
B ——absorptienorm (of monster)
B0 -- absorptie nul standaard
10.2 Standaardbocht
----Om een standaardkromme te tekenen: Neem de absorptiewaarde van standaarden als y-as, semi-logaritmisch van de concentratie van de tylosine-standaardoplossing (ppb) als x-as.
---- De tylosineconcentratie van elk monster (ppb), die kan worden afgelezen van de kalibratiecurve, wordt vermenigvuldigd met de overeenkomstige verdunningsfactor van elk gevolgd monster en de werkelijke concentratie van het monster wordt verkregen.
Let alstublieft op:
Voor data-analyse is speciale software ontwikkeld, die op verzoek kan worden geleverd.
11. Gevoeligheid, nauwkeurigheid en precisie
Testgevoeligheid:1,5ppb
Detectie limiet:
Dierlijk weefsel………………………………………… 1,5ppb Melk……………………………………………….....…..15ppb Nauwkeurigheid:
Dierlijk weefsel…………………………...…………80±15%
Melk……………………………………..………….……80±10%
Precisie:
Variatiecoëfficiënt van de ELISA-kit is minder dan 10%.
12. Kennisgeving
12.1 De gemiddelde waarden van de absorptiewaarden verkregen voor de standaarden en de monsters worden verlaagd als de reagentia en monsters niet op kamertemperatuur (20-25℃) zijn gebracht.
12.2 Laat de microwells niet tussen de stappen drogen om mislukte reproduceerbaarheid te voorkomen en voer de volgende stap onmiddellijk uit nadat u op de microwells-houder tikt.
12.3 Schud elk reagens voorzichtig voor gebruik.
12.4 Houd uw huid uit de buurt van de stopoplossing, want deze is 0,5 MH2SO4oplossing.
12.5 Gebruik geen verouderde kits.Wissel de reagentia van verschillende batches niet uit, anders zal de gevoeligheid dalen.
12.6 Houd de ELISA-kits op 2-8 ℃, bevries niet.Sluit rustende microwell-platen af, vermijd direct zonlicht tijdens alle incubaties.Het wordt aanbevolen om de microtiterplaten af te dekken.
12.7 Substraatoplossing moet worden opgegeven als deze verkleurt.De reagentia kunnen slecht worden als de absorptiewaarde (450/630nm) van de nulstandaard lager is dan 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 De kleuringsreactie heeft 15 minuten nodig na toevoeging van oplossing A en oplossing B. En u kunt de incubatietijd verlengen tot 20 minuten of meer als de kleur te licht is om te bepalen.Nooit langer dan 30 minuten, integendeel, verkort de incubatietijd goed.
12.9 De optimale reactietemperatuur is 37℃.Hogere of lagere temperaturen leiden tot veranderingen in gevoeligheid en absorptiewaarden.
13. Opslag
Bewaarconditie: 2-8℃.
Bewaartermijn: 12 maanden.
