ການແຂ່ງຂັນ Enzyme Immunoassay Kit ສໍາລັບການວິເຄາະປະລິມານຂອງ Tylosin
ການແຂ່ງຂັນ Enzyme Immunoassay Kit ສໍາລັບ
ການວິເຄາະປະລິມານຂອງໄທໂລຊິນ
1. ຄວາມເປັນມາ
ໄທໂລຊິນແມ່ນຢາຕ້ານເຊື້ອ macrolide, ເຊິ່ງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໃຊ້ເປັນຢາຕ້ານເຊື້ອແລະຕ້ານ mycoplasma.MRLs ທີ່ເຂັ້ມງວດໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນນັບຕັ້ງແຕ່ຢານີ້ອາດຈະນໍາໄປສູ່ຜົນຂ້າງຄຽງທີ່ຮ້າຍແຮງໃນບາງກຸ່ມ.
ຊຸດນີ້ແມ່ນຜະລິດຕະພັນໃຫມ່ໂດຍອີງໃສ່ເທກໂນໂລຍີ ELISA, ເຊິ່ງໄວ, ງ່າຍ, ຖືກຕ້ອງແລະມີຄວາມອ່ອນໄຫວເມື່ອທຽບກັບການວິເຄາະເຄື່ອງມືທົ່ວໄປແລະຕ້ອງການພຽງແຕ່ 1.5 ຊົ່ວໂມງໃນຫນຶ່ງການດໍາເນີນງານ, ມັນສາມາດຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດການດໍາເນີນງານແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງການເຮັດວຽກໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.
2. ຫຼັກການທົດສອບ
ຊຸດນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ເຕັກໂນໂລຢີ ELISA ທີ່ແຂ່ງຂັນທາງອ້ອມ.ນໍ້າສ້າງ microtiter ໄດ້ຖືກເຄືອບດ້ວຍ antigen coupling.Tylosin residue ໃນຕົວຢ່າງຈະແຂ່ງຂັນກັບ antigen ທີ່ເຄືອບຢູ່ໃນແຜ່ນ microtiter ສໍາລັບ antibody.ຫຼັງຈາກການເພີ່ມຂອງ enzyme ທີ່ຕິດສະຫຼາກຕ້ານ antibody, TMB substrate ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນສີ.ການດູດຊຶມຂອງຕົວຢ່າງແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບທາງລົບກັບ tylosin ທີ່ອາໄສຢູ່ໃນມັນ, ຫຼັງຈາກປຽບທຽບກັບເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ, ຄູນດ້ວຍປັດໃຈການເຈືອຈາງ, ປະລິມານການຕົກຄ້າງຂອງ tylosin ໃນຕົວຢ່າງສາມາດຖືກຄິດໄລ່.
3. ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ
ຊຸດນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໃນການວິເຄາະປະລິມານແລະຄຸນນະພາບຂອງສານຕົກຄ້າງ tylosin ໃນເນື້ອເຍື່ອສັດ (ໄກ່, ຫມູ, ເປັດ) ແລະນົມ, ນໍ້າເຜິ້ງ, ໄຂ່, ແລະອື່ນໆ.
4. ປະຕິກິລິຍາຂ້າມ
Tylosin………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. ວັດສະດຸທີ່ຕ້ອງການ
5.1 ອຸປະກອນ:
---- ເຄື່ອງວັດແທກແຜ່ນ microtiter (450nm / 630nm)
---- ເຄື່ອງລະເຫີຍ Rotary ຫຼືເຄື່ອງມືເຮັດໃຫ້ແຫ້ງໄນໂຕຣເຈນ
---- ເຄື່ອງປະສົມ
---- ເຄື່ອງສັ່ນ
----ສູນກາງ
---- ການດຸ່ນດ່ຽງການວິເຄາະ (inductance: 0.01g)
---- pipette ຈົບການສຶກສາ: 10ml
---- ທໍ່ທໍ່ຢາງ
---- ປະລິມານ: 10ml
---- ທໍ່ centrifuge polystyrene: 50ml
---- Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Reagents:
----ໂຊດຽມໄຮໂດຣໄຊ (NaOH, AR)
---- Sodium bicarbonate (NaHCO3,AR)
---- ໂຊດຽມຄາບອນ (NaCO3, AR)
----ອາຊິດ Trichloroacetic (AR)
---- ອາເຊໂຕໄນໄຕ (AR)
----ເອທິລອາຊີຕາດ (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
---- ນ້ໍາ Deionized
6. ອົງປະກອບຊຸດ
l ແຜ່ນ Microtiter ມີ 96 ຮູທີ່ເຄືອບດ້ວຍ antigen
l ວິທີແກ້ໄຂມາດຕະຖານ (5 ຂວດ, 1ml / ຕຸກ)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l ການຄວບຄຸມມາດຕະຖານ Spiking: (1ml / ຂວດ)1 ppm
l Enzyme conjugate 1ml ………………..…..… ຝາແດງ
l Antibody solution 7ml……………….……ຝາສີຂຽວ
l Solution A 7ml…………………….….……ຝາສີຂາວ
l Solution B 7ml …………………………….. ຝາແດງ
l Stop solution 7ml.……………….……….ຝາສີເຫລືອງ
l 20× ນໍ້າສະອາດເຂັ້ມຂຸ້ນ 40ml
…………………………………………..… ຝາປິດໂປ່ງໃສ
l 4× ສານສະກັດຈາກເຂັ້ມຂຸ້ນ 50ml
……………………………………………….ໝວກສີຟ້າ
7. ການກະກຽມ Reagents:
ການແກ້ໄຂ 1:ການແກ້ໄຂ NaOH 0.1mol/L
ນໍ້າໜັກ 0.4g NaOH ຫາ 100ml ນໍ້າ deionized ແລະປະສົມຢ່າງສົມບູນ.
ການແກ້ໄຂ 2: 1mol/L NaOH solution
ນ້ຳໜັກ 4g NaOH ຫາ 100ml deionized water ແລະປະສົມໃຫ້ເຂົ້າກັນຢ່າງສົມບູນ.
ການແກ້ໄຂ 3: ເກືອກາກບອນ
ການແກ້ໄຂ1: 0.2M PB
ລະລາຍ 51.6g Na2HPO4· 12H2O, 8.7g ຂອງ NaH2PO4· 2H2O ດ້ວຍນ້ໍາ deionized ແລະ dilute ກັບ 1000ml.
ການແກ້ໄຂ2: ການແກ້ໄຂການສະກັດ
ເຈືອຈາງສານສະກັດຈາກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 2 × ດ້ວຍນ້ໍາ deionized ໃນອັດຕາສ່ວນປະລິມານຂອງ 1: 1 (.ຕົວຢ່າງ: 10ml ຂອງການແກ້ໄຂການສະກັດເອົາ 2 × + 10ml ຂອງນ້ໍາ deionized), ຊຶ່ງຈະຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດເອົາຕົວຢ່າງ,ການແກ້ໄຂນີ້ສາມາດຖືກເກັບໄວ້ໃນ 4 ℃ສໍາລັບ 1 ເດືອນ.
ການແກ້ໄຂ3: ລ້າງການແກ້ໄຂ
ເຈືອຈາງສານລ້າງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 20× ດ້ວຍນ້ໍາ deionized ໃນອັດຕາສ່ວນປະລິມານຂອງ 1:19 (.ຕົວຢ່າງ: 5ml ຂອງ 20 × wash solution + 95ml ຂອງ deionized ນ້ໍາ), ຊຶ່ງຈະຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການລ້າງແຜ່ນ.ການແກ້ໄຂນີ້ສາມາດຖືກເກັບໄວ້ໃນ 4 ℃ສໍາລັບ 1 ເດືອນ.
8. ການກະກຽມຕົວຢ່າງ
8.1 ແຈ້ງການ ແລະ ຂໍ້ຄວນລະວັງກ່ອນການດຳເນີນງານ:
(a) ກະລຸນາໃຊ້ຄໍາແນະນໍາແບບດຽວໃນຂະບວນການທົດລອງ, ແລະປ່ຽນຄໍາແນະນໍາໃນເວລາທີ່ດູດຊຶມ reagent ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.
(b) ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າອຸປະກອນທັງຫມົດແມ່ນສະອາດ.
(c) ເກັບຕົວຢ່າງເນື້ອເຍື່ອໃນ freeze.
(d) ຕົວຢ່າງທີ່ກຽມໄວ້ຄວນຖືກໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະໃນເວລາດຽວກັນ.
8.2 ເນື້ອເຍື່ອສັດ (ໄກ່, ຫມູ, ແລະອື່ນໆ)
----Homogenize ຕົວຢ່າງກັບ homogenizer;
---- ເອົາ 2.0±0.05g ຂອງ homogenate ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ centrifuge polystyrene 50ml;ເພີ່ມ 2ml ຂອງ 0.2M PB (ການແກ້ໄຂ1) , ສັ່ນໃຫ້ລະລາຍ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມ 8ml ຂອງ ethyl acetate ແລະສັ່ນຢ່າງຮຸນແຮງສໍາລັບ 3 ນາທີ;
---- Centrifuge ສໍາລັບການແຍກ: 3000g / ອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ / 5min.
---- ໂອນ 4ml ຂອງໄລຍະອິນຊີ supernatant ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ແກ້ວ 10ml, ແຫ້ງດ້ວຍອາບນ້ໍາ 50-60 ℃ພາຍໃຕ້ກະແສອາຍແກັສໄນໂຕຣເຈນ;
----ລະລາຍສ່ວນທີ່ເຫຼືອແຫ້ງດ້ວຍ 1ml ຂອງ n-hexane, vortex 30s ໃຫ້ລະລາຍ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມ 1ml ຂອງສານສະກັດຈາກ (.ການແກ້ໄຂ2), vortex ສໍາລັບ 1 ນາທີ.centrifuge ສໍາລັບການແຍກ: 3000g / ອຸນຫະພູມອາກາດລ້ອມຮອບ / 5min
----ເອົາໄລຍະ supernatant n-hexane;ເອົາ 50μl ຂອງໄລຍະທີ່ມີນ້ໍາຍ່ອຍສໍາລັບການວິເຄາະ.
ປັດໄຈການເຈືອຈາງ: 1
8.2 ນົມ
---- ເອົາຕົວຢ່າງນົມດິບ 100μl, ປະສົມກັບສານສະກັດຈາກ 900μl (ການແກ້ໄຂ2), ແລະປະສົມຢ່າງສົມບູນ.
---- ເອົາ 50μl ຂອງການແກ້ໄຂທີ່ກຽມໄວ້ສໍາລັບການວິເຄາະ.
ປັດໄຈການເຈືອຈາງ: 10
9. ຂະບວນການວິເຄາະ
9.1 ແຈ້ງກ່ອນການສອບເສັງ
9.1.1ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າ reagents ແລະ microwells ທັງຫມົດຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (20-25 ℃).
9.1.2ກັບຄືນ reagents ທັງຫມົດສ່ວນທີ່ເຫຼືອເປັນ 2-8℃ທັນທີຫຼັງຈາກການນໍາໃຊ້.
9.1.3ການລ້າງ microwells ຢ່າງຖືກຕ້ອງແມ່ນຂັ້ນຕອນທີ່ສໍາຄັນໃນຂະບວນການກວດສອບ;ມັນເປັນປັດໃຈສໍາຄັນຕໍ່ການແຜ່ພັນຂອງການວິເຄາະ ELISA.
9.1.4 ກຫ້າມແສງສະຫວ່າງແລະກວມເອົາ microwells ໃນລະຫວ່າງການ incubation.
9.2 ຂັ້ນຕອນການວິເຄາະ
9.2.1 ເອົາ reagents ທັງຫມົດອອກໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (20-25℃) ຫຼາຍກ່ວາ 30 ນາທີ, ສັ່ນຄ່ອຍໆກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.
9.2.2 ເອົາ microwells ທີ່ຈໍາເປັນອອກແລະກັບຄືນສ່ວນທີ່ເຫຼືອເຂົ້າໄປໃນຖົງ zip-lock ຢູ່ທີ່ 2-8 ℃ທັນທີ.
9.2.3 ການແກ້ໄຂການລ້າງທີ່ເຈືອຈາງຄວນໄດ້ຮັບການອົບອຸ່ນຄືນໃຫມ່ເພື່ອໃຫ້ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງກ່ອນທີ່ຈະນໍາໃຊ້.
9.2.4ຈໍານວນ:ເລກທຸກຕໍາແໜ່ງໄມໂຄເວວ ແລະທຸກມາດຕະຖານ ແລະຕົວຢ່າງຄວນຈະຖືກດໍາເນີນການຊໍ້າກັນ.ບັນທຶກມາດຕະຖານແລະຕົວຢ່າງຕໍາແຫນ່ງ.
9.2.5Add ມາດຕະຖານການແກ້ໄຂ/ຕົວຢ່າງ ແລະການແກ້ໄຂພູມຕ້ານທານ: ເພີ່ມ 50µl ຂອງການແກ້ໄຂມາດຕະຖານ ((ຊຸດສະຫນອງໃຫ້)) ຫຼືຕົວຢ່າງທີ່ກຽມໄວ້ກັບນໍ້າສ້າງທີ່ສອດຄ້ອງກັນ.ເພີ່ມ 50µl ຂອງການແກ້ໄຂ antibody (ຊຸດສະຫນອງໃຫ້).ປະສົມຄ່ອຍໆໂດຍການສັ່ນແຜ່ນດ້ວຍຕົນເອງແລະ incubate ສໍາລັບການ 30 ນາທີທີ່ 37 ℃ດ້ວຍການປົກຫຸ້ມຂອງ.
9.2.6ລ້າງ: ເອົາຝາປິດອອກຄ່ອຍໆ ແລະ ລ້າງນໍ້າອອກຈາກນໍ້າສ້າງ ແລະລ້າງໄມໂຄເວວດ້ວຍນໍ້າຢາລ້າງນໍ້າທີ່ເສື່ອມ 250µl (ການແກ້ໄຂ3) ໃນຊ່ວງເວລາ 10s ສໍາລັບ 4-5 ຄັ້ງ.ດູດນ້ໍາທີ່ຕົກຄ້າງດ້ວຍກະດາດດູດຊຶມ (ຟອງອາກາດສ່ວນທີ່ເຫຼືອສາມາດຖືກກໍາຈັດດ້ວຍປາຍທີ່ບໍ່ໄດ້ໃຊ້).
9.2.7ເພີ່ມ enzyme conjugate: ເພີ່ມ 100ml ຂອງ enzyme conjugate solution (ຊຸດສະຫນອງໃຫ້) ໃສ່ແຕ່ລະດີ, ປະສົມຄ່ອຍໆແລະ incubate ສໍາລັບການ 30 ນາທີທີ່ 37 ℃ດ້ວຍການປົກຫຸ້ມ.ເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນການລ້າງອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.
9.2.8ສີ: ເພີ່ມ 50µl ຂອງການແກ້ໄຂ A(ຊຸດສະຫນອງໃຫ້) ແລະ 50µl ຂອງການແກ້ໄຂ B(ຊຸດສະຫນອງໃຫ້) ກັບແຕ່ລະຫນອງ.ປະສົມຢ່າງອ່ອນໂຍນແລະ incubate ສໍາລັບ 15 ນາທີທີ່ 37°C ມີການປົກຫຸ້ມຂອງ.
9.2.9ວັດແທກ: ເພີ່ມ 50µl ຂອງການແກ້ໄຂຢຸດ (ຊຸດສະຫນອງໃຫ້) ກັບແຕ່ລະຫນອງ.ປະສົມຄ່ອຍໆແລະວັດແທກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 450nm (ມັນແນະນໍາການວັດແທກທີ່ມີຄວາມຍາວສອງຄື້ນຂອງ 450/630nm. ອ່ານຜົນໄດ້ຮັບພາຍໃນ 5 ນາທີຫຼັງຈາກເພີ່ມການແກ້ໄຂຢຸດ).
10. ຜົນໄດ້ຮັບ
10.1 ອັດຕາສ່ວນການດູດຊຶມ
ຄ່າສະເລ່ຍຂອງຄ່າການດູດຊຶມທີ່ໄດ້ຮັບມາດຕະຖານ ແລະຕົວຢ່າງຖືກແບ່ງອອກດ້ວຍຄ່າການດູດຊຶມຂອງມາດຕະຖານທຳອິດ (ມາດຕະຖານສູນ) ແລະຄູນດ້ວຍ 100%.ດັ່ງນັ້ນມາດຕະຖານສູນແມ່ນເຮັດໃຫ້ເທົ່າກັບ 100% ແລະຄ່າການດູດຊຶມໄດ້ຖືກອ້າງອີງເປັນເປີເຊັນ.
B
ການດູດຊຶມ (%) = —— × 100%
B0
B — ມາດຕະຖານການດູດຊຶມ (ຫຼືຕົວຢ່າງ)
B0 — ມາດຕະຖານການດູດຊຶມສູນ
10.2 ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ
---- ເພື່ອແຕ້ມເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ: ເອົາຄ່າການດູດຊຶມຂອງມາດຕະຖານເປັນແກນ y, ເຄິ່ງ logarithmic ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງການແກ້ໄຂມາດຕະຖານ tylosin (ppb) ເປັນແກນ x.
---- ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ tylosin ຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງ (ppb), ເຊິ່ງສາມາດອ່ານໄດ້ຈາກເສັ້ນໂຄ້ງການປັບຕົວ, ຖືກຄູນດ້ວຍປັດໃຈ Dilution ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງທີ່ປະຕິບັດຕາມ, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕົວຈິງຂອງຕົວຢ່າງແມ່ນໄດ້ຮັບ.
ກະລຸນາສັງເກດ:
ຊອບແວພິເສດໄດ້ຖືກພັດທະນາສໍາລັບການວິເຄາະຂໍ້ມູນ, ເຊິ່ງສາມາດສະຫນອງໃຫ້ຕາມຄໍາຮ້ອງຂໍ.
11. ຄວາມອ່ອນໄຫວ, ຄວາມຖືກຕ້ອງແລະຄວາມແມ່ນຍໍາ
ຄວາມອ່ອນໄຫວການທົດສອບ:1.5ppb
ຂີດຈຳກັດໃນການກວດຫາ:
ເນື້ອເຍື່ອສັດ……………………………………………1.5ppb ນົມ …………………………………………….…..15ppb ຄວາມຖືກຕ້ອງ:
ເນື້ອເຍື່ອສັດ ……………………………………80±15%
ນົມ…………………………………..……….……80±10%
ຄວາມຊັດເຈນ:
ຄ່າສໍາປະສິດການປ່ຽນແປງຂອງຊຸດ ELISA ແມ່ນຫນ້ອຍກວ່າ 10%.
12. ແຈ້ງການ
12.1 ຄ່າສະເລ່ຍຂອງຄ່າການດູດຊຶມທີ່ໄດ້ຮັບມາດຕະຖານແລະຕົວຢ່າງຈະຫຼຸດລົງຖ້າຫາກວ່າ reagents ແລະຕົວຢ່າງບໍ່ໄດ້ຖືກຄວບຄຸມກັບອຸນຫະພູມຫ້ອງ (20-25 ℃).
12.2 ຢ່າປ່ອຍໃຫ້ microwells ແຫ້ງລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການແຜ່ພັນທີ່ບໍ່ສໍາເລັດຜົນແລະດໍາເນີນການຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປທັນທີຫຼັງຈາກແຕະທີ່ຖື microwells.
12.3 ສັ່ນນ້ຳຢາແຕ່ລະອັນຄ່ອຍໆກ່ອນນຳໃຊ້.
12.4 ຮັກສາຜິວຫນັງຂອງທ່ານຢູ່ຫ່າງຈາກການແກ້ໄຂຢຸດສໍາລັບມັນແມ່ນ 0.5MH2SO4ການແກ້ໄຂ.
12.5 ຢ່າໃຊ້ຊຸດທີ່ລ້າສະໄຫມ.ຢ່າແລກປ່ຽນ reagents ຂອງ batches ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະຫຼຸດລົງຄວາມອ່ອນໄຫວ.
12.6 ຮັກສາຊຸດ ELISA ຢູ່ທີ່ 2-8 ℃, ຢ່າແຊ່ແຂງ.ປະທັບຕາແຜ່ນ microwell ສ່ວນທີ່ເຫຼືອ, ຫຼີກເວັ້ນການແສງແດດຊື່ໃນລະຫວ່າງການ incubation ທັງຫມົດ.ແນະນໍາໃຫ້ກວມເອົາແຜ່ນ microtiter.
12.7 ການແກ້ໄຂ substrate ຄວນຖືກປະຖິ້ມຖ້າມັນປ່ຽນສີ.ທາດ reagents ອາດຈະເຮັດໃຫ້ບໍ່ດີຖ້າຫາກວ່າຄ່າການດູດຊຶມ (450/630nm) ຂອງມາດຕະຖານສູນແມ່ນຫນ້ອຍກ່ວາ 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 ປະຕິກິລິຍາການໃສ່ສີຕ້ອງໃຊ້ເວລາ 15 ນາທີ ຫຼັງຈາກການຕື່ມຂອງການແກ້ໄຂ A ແລະການແກ້ໄຂ B. ແລະທ່ານສາມາດຍືດເວລາການອົບເປັນ 20 ນາທີ ຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນ ຖ້າສີອ່ອນເກີນໄປທີ່ຈະຖືກກໍານົດ.ບໍ່ເກີນ 30 ນາທີ, ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ເຮັດໃຫ້ເວລາ incubation ສັ້ນລົງ.
12.9 ອຸນຫະພູມຕິກິຣິຍາທີ່ດີທີ່ສຸດແມ່ນ 37 ℃.ອຸນຫະພູມທີ່ສູງຂຶ້ນຫຼືຕ່ໍາຈະນໍາໄປສູ່ການປ່ຽນແປງຂອງຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄ່າການດູດຊຶມ.
13. ການເກັບຮັກສາ
ສະພາບເກັບຮັກສາ: 2-8 ℃.
ໄລຍະເວລາເກັບຮັກສາ: 12 ເດືອນ.
