Competitive Enzyme Immunoassay Kit para sa Quantitative Analysis ng Tylosin
Competitive Enzyme Immunoassay Kit para sa
Quantitative Analysis ngTylosin
1. Background
Tylosinay isang macrolide antibiotic, na pangunahing ginagamit bilang antibacterial at anti-mycoplasma.Ang mga mahigpit na MRL ay naitatag dahil ang gamot na ito ay maaaring humantong sa malubhang epekto sa ilang partikular na grupo.
Ang kit na ito ay isang bagong produkto batay sa teknolohiya ng ELISA, na mabilis, madali, tumpak at sensitibo kumpara sa karaniwang instrumental na pagsusuri at nangangailangan lamang ng 1.5 oras sa isang operasyon, maaari nitong lubos na mabawasan ang error sa operasyon at intensity ng trabaho.
2. Prinsipyo ng Pagsubok
Ang kit na ito ay batay sa hindi direktang mapagkumpitensyang teknolohiyang ELISA.Ang mga balon ng microtiter ay pinahiran ng coupling antigen.Ang tylosin residue sa sample ay nakikipagkumpitensya sa antigen na pinahiran sa microtiter plate para sa antibody.Pagkatapos ng pagdaragdag ng enzyme na may label na anti-antibody, ang TMB substrate ay ginagamit upang ipakita ang kulay.Ang pagsipsip ng sample ay negatibong nauugnay sa tylosin na naninirahan dito, pagkatapos ng paghahambing sa Standard Curve, na pinarami ng dilution factor, ang tylosin residue quantity sa sample ay maaaring kalkulahin.
3. Mga aplikasyon
Ang kit na ito ay maaaring gamitin sa quantitative at qualitative analysis ng tylosin residue sa tissue ng hayop (manok, baboy, pato) at gatas, pulot, itlog, atbp.
4. Mga cross-reaksyon
Tylosin……………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. Mga Materyales na Kinakailangan
5.1 Mga Kagamitan:
----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)
----Rotary evaporator o nitrogen drying instruments
----homogenizer
----Kalog
----Centrifuge
----Analytical na balanse (inductance: 0.01g)
----Nagtapos na pipette: 10ml
----Goma pipette bombilya
----Volumetric flask: 10ml
----Polystyrene centrifuge tubes: 50ml
----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Reagents:
----Sodium hydroxide (NaOH, AR)
----Sodium bikarbonate (NaHCO3,AR)
---- Sodium carbonate (NaCO3, AR)
----Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Ethyl acetate (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Deionized na tubig
6. Mga Bahagi ng Kit
l Microtiter plate na may 96 na balon na pinahiran ng antigen
l Mga karaniwang solusyon(5 bote,1ml/bote)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standard control: (1ml/bote)1ppm
l Enzyme conjugate 1ml………………………..pulang takip
l Antibody solution 7ml………………………….berdeng takip
l Solusyon A 7ml………………………………..puting takip
l Solusyon B 7ml...…………………………………..pulang takip
l Ihinto ang solusyon 7ml.…………………………………….dilaw na takip
l 20×concentrated wash solution 40ml
…………………………………..…transparent na takip
l 4×concentrated extraction solution 50ml
…………………………………………….asul na takip
7. Paghahanda ng Reagents:
Solusyon 1:0.1mol/L na solusyon sa NaOH
Timbangin ang 0.4g NaOH hanggang 100ml na deionized na tubig at ihalo nang buo.
Solusyon 2: 1mol/L NaOH na solusyon
Timbangin ang 4g NaOH hanggang 100ml na deionized na tubig at ihalo nang lubusan.
Solusyon 3: Carbonate buffer salt
Solusyon1: 0.2M PB
I-dissolve ang 51.6g ng Na2HPO4·12H2O, 8.7g ng NaH2PO4·2H2O na may deionized na tubig at palabnawin sa 1000ml.
Solusyon2: Solusyon sa pagkuha
Dilute ang 2×concentrated extraction solution na may deionized water sa volume ratio na 1:1(hal. 10ml ng 2×extraction solution + 10ml ng deionized na tubig), na gagamitin para sa sample extraction,ang solusyon na ito ay maaaring itago sa 4 ℃ sa loob ng 1 buwan.
Solusyon3: Hugasan ang solusyon
Dilute ang 20×concentrated wash solution na may deionized na tubig sa volume ratio na 1:19(hal. 5ml ng 20×wash solution + 95ml ng deionized na tubig), na gagamitin para sa paghuhugas ng mga plato.Ang solusyon na ito ay maaaring maiimbak sa 4 ℃ sa loob ng 1 buwan.
8. Mga Halimbawang Paghahanda
8.1 Paunawa at pag-iingat bago ang operasyon:
(a) Mangyaring gumamit ng mga one-off na tip sa proseso ng eksperimento, at baguhin ang mga tip kapag sumipsip ng ibang reagent.
(b) Siguraduhing malinis ang lahat ng instrumento.
(c) Panatilihin ang sample ng tissue sa freeze.
(d) Ang inihandang sample ay dapat gamitin para sa pagsusuri nang sabay-sabay.
8.2 tissue ng hayop (manok, baboy, atbp)
----I-homogenize ang sample gamit ang homogenizer;
---- Dalhin ang 2.0±0.05g ng homogenate sa isang 50ml polystyrene centrifuge tube;magdagdag ng 2ml ng 0.2M PB (solusyon1) , iling upang matunaw, at pagkatapos ay idagdag ang 8ml ng ethyl acetate at iling nang malakas sa loob ng 3min;
----Centrifuge para sa paghihiwalay: 3000g / ambient temperature / 5min.
----Ilipat ang 4ml ng supernatant organic phase sa isang 10ml glass tube, tuyo na may 50-60 ℃ na paliguan ng tubig sa ilalim ng stream ng nitrogen gas;
----I-dissolve ang tuyong tira na may 1ml ng n-hexane, vortex para sa 30s upang matunaw, at pagkatapos ay magdagdag ng 1ml ng extraction solution (solusyon2), puyo ng tubig para sa 1 min.centrifuge para sa paghihiwalay: 3000g / ambient temperature / 5min
----Alisin ang supernatant n-hexane phase;kumuha ng 50μl ng substrate aqueous phase para sa assay.
Salik ng dilution: 1
8.2 Gatas
----Kumuha ng 100μl ng raw milk sample, ihalo sa 900μl ng extraction solution (solusyon2), at ihalo nang lubusan.
----Kumuha ng 50μl ng inihandang solusyon para sa assay.
Salik ng pagbabanto: 10
9. Proseso ng pagsusuri
9.1 Pansinin bago ang pagsusuri
9.1.1Siguraduhin na ang lahat ng mga reagents at microwell ay nasa temperatura ng silid (20-25 ℃).
9.1.2Ibalik ang lahat ng natitirang reagents sa 2-8℃kaagad pagkatapos gamitin.
9.1.3Ang wastong paghuhugas ng mga microwell ay isang mahalagang hakbang sa proseso ng pagsusuri;ito ang mahalagang kadahilanan sa muling paggawa ng pagsusuri ng ELISA.
9.1.4 Aalisin ang liwanag at takpan ang mga microwell sa panahon ng pagpapapisa ng itlog.
9.2 Mga Hakbang sa Pagsusuri
9.2.1 Ilabas ang lahat ng reagents sa temperatura ng silid (20-25 ℃) nang higit sa 30min, iling nang marahan bago gamitin.
9.2.2 Ilabas ang mga microwell na kailangan at ibalik kaagad ang natitira sa zip-lock bag sa 2-8 ℃.
9.2.3 Ang diluted na wash solution ay dapat na painitin muli upang nasa temperatura ng silid bago gamitin.
9.2.4Numero:Nilagyan ng bilang ang bawat posisyon ng microwell at lahat ng mga pamantayan at sample ay dapat patakbuhin nang doble.Itala ang mga pamantayan at mga sample na posisyon.
9.2.5Add standard solution/sample at antibody solution: Magdagdag ng 50µl ng karaniwang solusyon((ibinigay na kit)) o inihandang sample sa kaukulang mga balon.Magdagdag ng 50µl ng antibody solution(ibinigay na kit).Malumanay na paghaluin sa pamamagitan ng mano-manong pag-alog ng plato at i-incubate ng 30min sa 37 ℃ na may takip.
9.2.6Hugasan: Dahan-dahang tanggalin ang takip at dalisayin ang likido mula sa mga balon at banlawan ang mga microwell gamit ang 250µl diluted wash solution (solusyon3) sa pagitan ng 10s para sa 4-5 beses.Sipsipin ang natitirang tubig gamit ang sumisipsip na papel (ang natitirang bula ng hangin ay maaaring alisin gamit ang hindi nagamit na tip).
9.2.7Magdagdag ng enzyme conjugate: Magdagdag ng 100ml ng enzyme conjugate solution(ibinigay na kit) sa bawat balon, ihalo nang malumanay at i-incubate ng 30min sa 37 ℃ na may takip.Ulitin muli ang hakbang sa paghuhugas.
9.2.8Pangkulay: Magdagdag ng 50µl ng solusyon A(ibinigay na kit) at 50µl ng solusyon B(ibinigay na kit) sa bawat balon.Malumanay na paghaluin at i-incubate ng 15min sa 37 ℃ na may takip.
9.2.9Sukatin: Magdagdag ng 50µl ng stop solution(ibinigay na kit) sa bawat balon.Malumanay na paghaluin at sukatin ang absorbance sa 450nm (Iminungkahing sukat ito na may dalawahang wavelength na 450/630nm. Basahin ang resulta sa loob ng 5min pagkatapos magdagdag ng stop solution).
10. Mga Resulta
10.1 Porsiyento ng pagsipsip
Ang ibig sabihin ng mga halaga ng absorbance value na nakuha para sa mga pamantayan at ang mga sample ay hinati sa absorbance value ng unang pamantayan (zero standard ) at pinarami ng 100%.Ang zero standard ay ginawang katumbas ng 100% at ang mga halaga ng absorbance ay sinipi sa mga porsyento.
B
Pagsipsip (%) = —— ×100%
B0
B ——pamantayang pagsipsip (o sample)
B0 ——absorbance zero standard
10.2 Standard Curve
----Upang gumuhit ng karaniwang curve: Kunin ang absorbance value ng mga pamantayan bilang y-axis, semi logarithmic ng konsentrasyon ng tylosin standards solution (ppb) bilang x-axis.
----Ang tylosin concentration ng bawat sample (ppb), na mababasa mula sa calibration curve, ay pinarami ng katumbas na Dilution factor ng bawat sample na sinusundan, at ang aktwal na konsentrasyon ng sample ay nakuha.
Mangyaring mapansin:
espesyal na software ang binuo para sa pagsusuri ng data, na maaaring ibigay kapag hiniling.
11. Sensitivity, katumpakan at katumpakan
Sensitibo sa Pagsubok:1.5ppb
Limitasyon sa pagtuklas:
tissue ng hayop……………………………………………………1.5ppb Gatas………………………………………………………………15ppb Katumpakan:
tissue ng hayop……………………………………………… 80±15%
Gatas…………………………………………………… 80±10%
Katumpakan:
Ang koepisyent ng pagkakaiba-iba ng ELISA kit ay mas mababa sa 10%.
12. Pansinin
12.1 Ang ibig sabihin ng mga halaga ng mga halaga ng absorbance na nakuha para sa mga pamantayan at ang mga sample ay mababawasan kung ang mga reagents at sample ay hindi na-regulate sa temperatura ng silid (20-25 ℃).
12.2 Huwag hayaang matuyo ang mga microwell sa pagitan ng mga hakbang upang maiwasan ang hindi matagumpay na muling paggawa at patakbuhin ang susunod na hakbang kaagad pagkatapos i-tap ang lalagyan ng microwells.
12.3 Malumanay na kalugin ang bawat reagent bago gamitin.
12.4 Ilayo ang iyong balat sa stop solution dahil ito ay 0.5MH2SO4solusyon.
12.5 Huwag gamitin ang mga kit na luma na.Huwag ipagpalit ang mga reagents ng iba't ibang mga batch, kung hindi, ibababa nito ang sensitivity.
12.6 Panatilihin ang ELISA kit sa 2-8 ℃, huwag mag-freeze.Seal rest microwell plates, Iwasan ang direktang sikat ng araw sa lahat ng incubation.Inirerekomenda na takpan ang mga plato ng microtiter.
12.7 Ang substrate na solusyon ay dapat na iwanan kung ito ay nagiging kulay.Ang mga reagents ay maaaring maging masama kung ang absorbance value (450/630nm) ng zero standard ay mas mababa sa 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Ang reaksyon ng kulay ay nangangailangan ng 15min pagkatapos ng pagdaragdag ng solusyon A at solusyon B. At maaari mong pahabain ang mga saklaw ng oras ng pagpapapisa ng itlog sa 20min o higit pa kung ang kulay ay masyadong magaan upang matukoy.Huwag lumampas sa 30min, sa kabaligtaran, paikliin ang oras ng pagpapapisa ng itlog nang maayos.
12.9 Ang pinakamainam na temperatura ng reaksyon ay 37 ℃.Ang mas mataas o mas mababang temperatura ay hahantong sa mga pagbabago ng sensitivity at absorbance value.
13. Imbakan
Kondisyon ng imbakan: 2-8 ℃.
Panahon ng imbakan: 12 buwan.
