ürün

1. Arkaplan

Tylosinesas olarak antibakteriyel ve anti-mikoplazma olarak uygulanan bir makrolid antibiyotiktir.Bu ilaç belirli gruplarda ciddi yan etkilere yol açabileceğinden katı MRL'ler oluşturulmuştur.

Bu kit, yaygın enstrümantal analize kıyasla hızlı, kolay, doğru ve hassas olan ve tek işlemde yalnızca 1,5 saat gerektiren ELISA teknolojisine dayalı yeni bir üründür, işlem hatasını ve iş yoğunluğunu önemli ölçüde azaltabilir.

2. Test Prensibi

Bu kit, dolaylı rekabetçi ELISA teknolojisine dayanmaktadır.Mikrotiter oyukları, birleştirme antijeni ile kaplanır.Numunedeki tilosin kalıntısı, antikor için mikrotitre plakası üzerinde kaplanmış antijen ile rekabet eder.Enzim işaretli anti-antikor eklendikten sonra, rengi göstermek için TMB substratı kullanılır.Numunenin absorbansı içinde bulunan tylosin ile negatif ilişkilidir, Standart Eğri ile karşılaştırılarak dilüsyon faktörü ile çarpılarak numunedeki tylosin kalıntı miktarı hesaplanabilir.

3. Uygulamalar

Bu kit, hayvan dokusunda (tavuk, domuz, ördek) ve süt, bal, yumurta vb. tylosin kalıntısının kantitatif ve kalitatif analizinde kullanılabilir.

4. Çapraz reaksiyonlar

Tylosin………………………………………………..100%

Tilmikosin………………………………………………<2%

5. Gerekli Malzemeler

5.1 Ekipmanlar:

----Mikrotiter plaka spektrofotometresi (450nm/630nm)

---- Döner buharlaştırıcı veya nitrojen kurutma aletleri

---- homojenleştirici

----Shaker

----Santrifüj

----Analitik terazi (endüktans: 0.01g)

---- Dereceli pipet: 10ml

---- Kauçuk pipet ampulü

---- Hacimsel şişe: 10ml

----Polistiren santrifüj tüpleri: 50ml

---- Mikropipetler: 20-200ml, 100-1000ml

250ml çoklu pipet

5.2 Reaktifler:

----Sodyum hidroksit (NaOH, AR)

----Sodyum bikarbonat (NaHCO_3,AR)

---- Sodyum karbonat (NaCO₃, AR)

----Trikloroasetik asit (AR)

---- Asetonitril (AR)

----Etil asetat (AR)

┅┅n-Heksan (AR)

----Deiyonize su

6. Takım Bileşenleri

l Antijenle kaplanmış 96 kuyucuklu mikrotitre plakası

l Standart çözümler (5 şişe, 1 ml/şişe)

0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb

l Arttırma standart kontrolü: (1 ml/şişe)1ppm

l Enzim konjugatı 1ml…………..…..…kırmızı kapak

l Antikor solüsyonu 7ml……………….……yeşil kapak

l Çözüm A 7ml…………………….….……beyaz kapak

l Solüsyon B 7ml...…………………………..kırmızı kapak

l Stop solüsyonu 7ml.……………….……….sarı kapak

l 20×konsantre yıkama solüsyonu 40ml

………………………………..…şeffaf kapak

l 4×konsantre ekstraksiyon solüsyonu 50ml

……………………………………………….Mavi şapka

7. Reaktiflerin Hazırlanması:

Çözüm 1:0,1 mol/L NaOH çözeltisi

0,4 g NaOH'yi 100 ml deiyonize su ile tartın ve tamamen karıştırın.

Çözüm 2: 1mol/L NaOH çözeltisi

4 g NaOH'yi 100 ml deiyonize su ile tartın ve tamamen karıştırın.

Çözüm 3: Karbonat tampon tuzu

Çözüm1: 0,2 milyon PB

51.6g Na çözün₂HPO₄·12H₂O, 8.7g NaH₂PO₄·2H₂O deiyonize su ile ve 1000 ml'ye seyreltin.

Çözüm2: Ekstraksiyon çözümü

2×konsantre ekstraksiyon solüsyonunu 1:1 hacim oranında deiyonize su ile seyreltin(örneğin 10ml 2×ekstraksiyon solüsyonu + 10ml deiyonize su), numune ekstraksiyonu için kullanılacak olan,bu solüsyon 4°C'de 1 ay saklanabilir.

Çözüm3: Yıkama solüsyonu

20×konsantre yıkama solüsyonunu 1:19( hacim oranında deiyonize su ile seyreltin.örneğin 5 ml 20×yıkama solüsyonu + 95 ml deiyonize su), plakaları yıkamak için kullanılacaktır.Bu solüsyon 4°C'de 1 ay saklanabilir..

8. Örnek Hazırlıklar

8.1 Çalıştırmadan önceki bildirim ve önlemler:

(a) Lütfen deney sürecinde tek seferlik ipuçları kullanın ve farklı reaktifleri emdiğinizde uçları değiştirin.

(b) Tüm aletlerin temiz olduğundan emin olun.

(c) Doku örneğini dondurarak saklayın.

(d) Hazırlanan numune bir kerede test için kullanılmalıdır.

8.2 Hayvan dokusu (tavuk, domuz eti vb.)

----Numuneyi homojenleştirici ile homojenleştirin;

---- 2,0±0,05 g homojenatı 50 ml'lik bir polistiren santrifüj tüpüne alın;2 ml 0,2 M PB ekleyin (çözüm1) çözünmesi için çalkalayın ve ardından 8 ml etil asetat ekleyin ve 3 dakika şiddetli bir şekilde çalkalayın;

---- Ayırma için santrifüj: 3000g / ortam sıcaklığı / 5 dak.

---- Süpernatant organik fazın 4 ml'sini 10 ml'lik bir cam tüpe aktarın, nitrojen gazı akımı altında 50-60°C su banyosuyla kurutun;

----Kuru artığı 1 ml n-heksan ile çözün, 30 saniye vorteksleyin ve ardından 1 ml ekstraksiyon solüsyonu ekleyin (çözüm2), 1 dakika vorteksleyin.Ayırma için santrifüj: 3000g / ortam sıcaklığı / 5dk

----Yüzerdeki n-heksan fazını çıkarın;tahlil için substrat sulu fazından 50μl alın.

Seyreltme faktörü: 1

8.2 Süt

----100μl çiğ süt örneği alın, 900μl ekstraksiyon solüsyonu ile karıştırın (çözüm2) ve tamamen karıştırın.

----Tahlil için hazırlanan solüsyondan 50μl alın.

Seyreltme faktörü: 10

9. Tahlil süreci

9.1 Testten önce uyarı

9.1.1Tüm reaktiflerin ve mikrokuyuların oda sıcaklığında (20-25°C) olduğundan emin olun.

9.1.2Geri kalan tüm reaktifleri 2-8'e geri koyun℃kullanıldıktan hemen sonra.

9.1.3Mikrokuyucukların doğru şekilde yıkanması tahlil sürecinde önemli bir adımdır;ELISA analizinin tekrarlanabilirliği için hayati bir faktördür.

9.1.4 birışığı geçersiz kılın ve inkübasyon sırasında mikrokuyucukları kapatın.

9.2 Tahlil Adımları

9.2.1 Tüm reaktifleri oda sıcaklığında (20-25°C) 30 dakikadan fazla çıkarın, kullanmadan önce hafifçe çalkalayın.

9.2.2 Gerekli mikrokuyucukları çıkarın ve geri kalanını hemen 2-8°C'de fermuarlı poşete koyun.

9.2.3 Seyreltilmiş yıkama solüsyonu kullanımdan önce oda sıcaklığına gelmesi için yeniden ısıtılmalıdır.

9.2.4Sayı:Her mikrokuyu pozisyonu numaralandırılır ve tüm standartlar ve numuneler iki kopya halinde çalıştırılmalıdır.Standartları ve numune konumlarını kaydedin.

9.2.5Add standart solüsyon/numune ve antikor solüsyonu: 50µl standart solüsyon ekleyin((sağlanan kit)) veya ilgili kuyucuklara hazırlanan numune.50µl antikor solüsyonu ekleyin(sağlanan kit).Plakayı elle sallayarak hafifçe karıştırın ve 30 dakika 37°C'de kapakla inkübe edin.

9.2.6Yıkamak: Kapağı yavaşça çıkarın ve kuyulardaki sıvıyı saflaştırın ve mikrokuyucukları 250µl seyreltilmiş yıkama solüsyonu ile durulayın (çözüm3) 10 sn aralıklarla 4-5 kez.Artık suyu emici kağıtla emdirin (kalan hava kabarcığı kullanılmayan uç ile giderilebilir).

9.2.7Enzim eşleniği ekleyin: 100 ml enzim eşlenik solüsyonu ekleyin(sağlanan kit) her kuyucuğa hafifçe karıştırın ve 30 dakika 37°C'de kapakla inkübe edin.Yıkama adımını tekrar tekrarlayın.

9.2.8renklendirme: 50 µl solüsyon A ekleyin(sağlanan kit) ve 50 µl solüsyon B(sağlanan kit) her kuyuya.Yavaşça karıştırın ve 37°C'de kapakla birlikte 15 dakika inkübe edin.

9.2.9Ölçüm: 50µl stop solüsyonu ekleyin(sağlanan kit) her kuyuya.Yavaşça karıştırın ve 450nm'de absorbansı ölçün (450/630nm çift dalga boyu ile ölçüm yapılması önerilir. Durdurma solüsyonunu ekledikten sonra sonucu 5 dakika içinde okuyun).

10. Sonuçlar

10.1 Yüzde absorbans

Standartlar ve numuneler için elde edilen absorbans değerlerinin ortalama değerleri birinci standardın (sıfır standart) absorbans değerine bölünerek %100 ile çarpılır.Böylece sıfır standardı %100'e eşit yapılır ve soğurma değerleri yüzde olarak belirtilir.

B

Absorbans (%) = —— ×%100

B0

B ——absorbans standardı (veya numune)

B0 ——absorbans sıfır standardı

10.2 Standart Eğri

----Standart bir eğri çizmek için: Standartların absorbans değerini y ekseni olarak, tylosin standartları çözeltisinin (ppb) konsantrasyonunun yarı logaritmik olarak x ekseni olarak alın.

---- Kalibrasyon eğrisinden okunabilen her numunenin tylosin konsantrasyonu (ppb), takip edilen her numunenin karşılık gelen Seyreltme faktörü ile çarpılır ve numunenin gerçek konsantrasyonu elde edilir.

Lutfen dikkat ediniz:

veri analizi için özel bir yazılım geliştirilmiştir ve istek üzerine temin edilebilir.

11. Hassasiyet, doğruluk ve kesinlik

Test Hassasiyeti:1.5ppb

Algılama sınırı:

Hayvan dokusu………………………….……………1.5ppb Süt………………………………………….....…..15ppb Kesinlik:

Hayvan dokusu…………………………...…………80±15%

Süt………………………………..……….……80±10%

Hassas:

ELISA kitinin varyasyon katsayısı %10'dan azdır.

12. Bildirim

12.1 Standartlar ve numuneler için elde edilen absorbans değerlerinin ortalama değerleri, reaktifler ve numuneler oda sıcaklığına (20-25°C) ayarlanmamışsa düşecektir.

12.2 Başarısız tekrarlanabilirliği önlemek için mikrokuyuların adımlar arasında kurumasına izin vermeyin ve mikrokuyu tutucuya dokunduktan hemen sonra bir sonraki adımı çalıştırın.

12.3 Kullanmadan önce her reaktifi hafifçe çalkalayın.

12.4 0.5MH olduğu için cildinizi stop solüsyonundan uzak tutun₂SO₄çözüm.

12.5 Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.Farklı partilerin reaktiflerini değiştirmeyin, aksi takdirde hassasiyet düşer.

12.6 ELISA kitlerini 2-8°C'de tutun, dondurmayın.Dinlenme mikrokuyu plakalarını kapatın, Tüm inkübasyonlar sırasında doğrudan güneş ışığından kaçının.Mikrotitre plakalarının kaplanması tavsiye edilir.

12.7 Yüzey solüsyonu renk değiştirirse bırakılmalıdır.Sıfır standardının absorbans değeri (450/630nm) 0,5'ten (A450nm<0,5) küçükse reaktifler bozulabilir.

12.8 Renklendirme reaksiyonu, A çözeltisi ve B çözeltisi eklendikten sonra 15 dakikaya ihtiyaç duyar. Ve renk belirlenemeyecek kadar açıksa inkübasyon süresi aralıklarını 20 dakika veya daha fazla uzatabilirsiniz.Asla 30 dakikayı geçmeyin, aksine inkübasyon süresini uygun şekilde kısaltın.

12.9 Optimum reaksiyon sıcaklığı 37°C'dir.Daha yüksek veya daha düşük sıcaklık, hassasiyet ve absorbans değerlerinin değişmesine yol açacaktır.

13. Depolama

Saklama koşulu: 2-8°C.

Saklama süresi: 12 ay.