Seti ya Kinga ya Enzyme ya Ushindani kwa Uchambuzi wa Kiasi wa Tylosin
Kifurushi cha Immunoassay cha Enzyme cha Ushindani cha
Uchambuzi wa Kiasi chaTylosin
1. Usuli
Tylosinni antibiotic ya macrolide, ambayo hutumiwa hasa kama antibacterial na anti-mycoplasma.MRL kali hazijaanzishwa kwani dawa hii inaweza kusababisha athari mbaya katika vikundi fulani.
Seti hii ni bidhaa mpya kulingana na teknolojia ya ELISA, ambayo ni ya haraka, rahisi, sahihi na nyeti ikilinganishwa na uchanganuzi wa kawaida wa ala na inahitaji saa 1.5 tu katika operesheni moja, inaweza kupunguza kwa kiasi kikubwa hitilafu ya uendeshaji na ukubwa wa kazi.
2. Kanuni ya Mtihani
Seti hii inategemea teknolojia isiyo ya moja kwa moja ya ELISA.Visima vya microtiter vimefungwa na antijeni ya kuunganisha.Mabaki ya tylosin kwenye sampuli hushindana na antijeni iliyopakwa kwenye bati ndogo ya kingamwili.Baada ya kuongezwa kwa kimeng'enya kilichoitwa anti-antibody, substrate ya TMB hutumiwa kuonyesha rangi.Kutokuwepo kwa sampuli kunahusiana vibaya na tylosin inayokaa ndani yake, baada ya kulinganisha na Curve ya Kawaida, iliyozidishwa na kipengele cha dilution, kiasi cha mabaki ya tylosin katika sampuli kinaweza kuhesabiwa.
3. Maombi
Kitanda hiki kinaweza kutumika katika uchambuzi wa kiasi na ubora wa mabaki ya tylosin katika tishu za wanyama (kuku, nguruwe, bata) na maziwa, asali, yai, nk.
4. Athari za msalaba
Tylosin…………………………………………………..100%
Tilmicosin ………………………………………………<2%
5. Nyenzo Zinazohitajika
5.1 Vifaa:
----Kipima spectrophotometer ya sahani ndogo (450nm/630nm)
----Evaporator ya mzunguko au ala za kukausha naitrojeni
----homogenizer
----Mtikisaji
----Kituo
----Salio la uchanganuzi (inductance: 0.01g)
----Pipette iliyohitimu: 10ml
----Balbu ya bomba la mpira
---- chupa ya volumetric: 10ml
----Polystyrene centrifuge tubes: 50ml
----Miili ndogo: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multipipette
5.2 Vitendanishi:
----Hidroksidi ya sodiamu (NaOH, AR)
----- bicarbonate ya sodiamu (NaHCO3,AR)
---- Sodium carbonate (NaCO3, AR)
---- Asidi ya Trichloroacetic (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Ethyl acetate (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Maji yaliyochanganyika
6. Vipengele vya Kit
l Sahani ya Microtiter yenye visima 96 vilivyowekwa na antijeni
l Suluhisho za kawaida (chupa 5, 1ml / chupa)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Udhibiti wa kiwango cha Spiking: (1ml/chupa)1 ppm
l Enzyme conjugate 1ml……………..…..… kofia nyekundu
l Suluhisho la kingamwili 7ml……………………… kofia ya kijani kibichi
l Suluhisho A 7ml…………………….….…… kofia nyeupe
l Suluhisho B 7ml……………………………….. kofia nyekundu
l Suluhisho la 7ml.…………………………. kofia ya manjano
l 20 × ufumbuzi wa safisha ya kujilimbikizia 40ml
………………………………………….. kofia ya uwazi
l 4 × ufumbuzi wa kujilimbikizia uchimbaji 50ml
…………………………………………………. kofia ya bluu
7. Maandalizi ya Vitendanishi:
Suluhisho la 1:Suluhisho la 0.1mol/L NaOH
Pima 0.4g NaOH hadi 100ml ya maji yaliyotenganishwa na uchanganye kabisa.
Suluhisho la 2: 1mol/L suluhisho la NaOH
Pima 4g NaOH hadi 100ml ya maji yaliyotolewa na uchanganye kabisa.
Suluhisho la 3: Chumvi ya bafa ya kaboni
Suluhisho1: 0.2M PB
Futa 51.6g ya Na2HPO4· 12H2O, 8.7g ya NaH2PO4· 2H2O na maji yaliyotengwa na punguza hadi 1000ml.
Suluhisho2: Suluhisho la uchimbaji
Punguza suluhisho la 2 × kujilimbikizia la uchimbaji na maji yaliyotengwa kwa uwiano wa 1: 1 (mfano 10ml ya 2× ufumbuzi wa uchimbaji + 10ml ya maji yaliyotolewa), ambayo itatumika kwa uchimbaji wa sampuli,suluhisho hili linaweza kuhifadhiwa kwa 4 ℃ kwa mwezi 1.
Suluhisho3: Suluhisho la kuosha
Punguza suluhisho la kuosha lililokolea 20× kwa maji yaliyotolewa kwa uwiano wa 1:19 (kwa mfano 5ml ya 20× safisha ufumbuzi + 95ml ya maji deionized), ambayo itatumika kuosha sahani.Suluhisho hili linaweza kuhifadhiwa kwa 4 ℃ kwa mwezi 1.
8. Maandalizi ya Mfano
8.1 Ilani na tahadhari kabla ya operesheni:
(a) Tafadhali tumia vidokezo vya mara moja katika mchakato wa majaribio, na ubadilishe vidokezo unapochukua kitendanishi tofauti.
(b) Hakikisha kwamba vyombo vyote ni safi.
(c) Weka sampuli ya tishu katika kuganda.
(d) Sampuli iliyotayarishwa inapaswa kutumika kwa majaribio mara moja.
8.2 Tishu za wanyama (kuku, nguruwe, nk)
----Homogenize sampuli na homogenizer;
----Chukua 2.0±0.05g ya homojeni kwenye bomba la polystyrene centrifuge la 50ml;ongeza 2ml ya 0.2M PB (suluhisho1) , kutikisa ili kufuta, na kisha kuongeza 8ml ya acetate ya ethyl na kutikisa kwa ukali kwa 3min;
----Centrifuge ya kutenganisha: 3000g / halijoto iliyoko / 5min.
----Hamisha 4ml ya awamu ya kikaboni ya hali ya juu kwenye bomba la glasi la 10ml, kavu na umwagaji wa maji wa 50-60℃ chini ya mkondo wa gesi ya nitrojeni;
----Nyunyisha mabaki makavu kwa 1ml ya n-hexane, vortex kwa miaka 30 kuyeyusha, kisha ongeza 1ml ya myeyusho wa uchimbaji (suluhisho2), vortex kwa dakika 1.centrifuge kwa kujitenga: 3000g / joto la kawaida / 5min
----Ondoa awamu ya nguvu zaidi ya n-hexane;chukua 50μl ya awamu ya maji ya substrate kwa majaribio.
Sababu ya dilution: 1
8.2 Maziwa
----Chukua 100μl ya sampuli ya maziwa mbichi, changanya na 900μl ya myeyusho wa kukamuliwa (suluhisho2), na kuchanganya kabisa.
----Chukua 50μl ya suluhu iliyotayarishwa kwa ajili ya majaribio.
Sababu ya dilution: 10
9. Mchakato wa upimaji
9.1 Taarifa kabla ya majaribio
9.1.1Hakikisha vitendanishi vyote na chembechembe ndogo zote ziko kwenye joto la kawaida (20-25℃).
9.1.2Rudisha vitendanishi vyote kwa 2-8℃mara baada ya kutumika.
9.1.3Kuosha microwells kwa usahihi ni hatua muhimu katika mchakato wa kupima;ni sababu muhimu kwa uzazi wa uchambuzi wa ELISA.
9.1.4 Afuta mwanga na funika vijidudu wakati wa incubation.
9.2 Hatua za Upimaji
9.2.1 Ondoa vitendanishi vyote kwenye joto la kawaida (20-25℃) kwa zaidi ya dakika 30, tikisa taratibu kabla ya kuvitumia.
9.2.2 Toa visima vidogo vinavyohitajika na urudishe vingine kwenye mfuko wa kufunga zipu saa 2-8℃ mara moja.
9.2.3 Suluhisho la safisha la diluted linapaswa kuwashwa tena ili liwe kwenye joto la kawaida kabla ya matumizi.
9.2.4Nambari:Imeweka nambari kila nafasi ya visima vidogo na viwango vyote na sampuli zinapaswa kuendeshwa kwa nakala.Rekodi viwango na nafasi za sampuli.
9.2.5Add suluhisho/sampuli ya kawaida na suluhisho la kingamwili: Ongeza 50µl ya suluhisho la kawaida ((seti iliyotolewa)) au sampuli iliyotayarishwa kwa visima husika.Ongeza 50µl ya suluhisho la kingamwili (seti iliyotolewa)Changanya kwa upole kwa kutikisa sahani mwenyewe na uangulie kwa dakika 30 kwa joto la 37 ℃ na kifuniko.
9.2.6Osha: Ondoa kifuniko kwa upole na safi kioevu kutoka kwenye visima na suuza microwells kwa ufumbuzi wa 250µl wa kuosha ulio diluti.suluhisho3) kwa muda wa 10s kwa mara 4-5.Nywa maji yaliyobaki kwa karatasi ya kunyonya (puto la hewa lililobaki linaweza kuondolewa kwa ncha isiyotumika).
9.2.7Ongeza mchanganyiko wa enzyme: Ongeza 100ml ya enzyme conjugate ufumbuzi (seti iliyotolewa) kwa kila kisima, changanya kwa upole na uangulie kwa dakika 30 kwa joto la 37℃ na kifuniko.Kurudia hatua ya kuosha tena.
9.2.8Upakaji rangi: Ongeza 50µl ya suluhisho A (seti iliyotolewa) na 50µl ya suluhisho B (seti iliyotolewa) kwa kila kisima.Changanya kwa upole na uangulie kwa dakika 15 kwa joto la 37 ℃ na kifuniko.
9.2.9Pima: Ongeza 50µl ya suluhisho la kuacha (seti iliyotolewa) kwa kila kisima.Changanya kwa upole na upime ufyonzaji kwa 450nm (Inapendekezwa kipimo na urefu wa wimbi mbili wa 450/630nm. Soma matokeo ndani ya dakika 5 baada ya kuongeza suluhisho la kuacha).
10. Matokeo
10.1 Asilimia ya kunyonya
Thamani za wastani za viwango vya kunyonya zilizopatikana kwa viwango na sampuli zinagawanywa na thamani ya kunyonya ya kiwango cha kwanza (kiwango cha sifuri) na kuzidishwa kwa 100%.Kwa hivyo, kiwango cha sifuri kinafanywa kuwa sawa na 100% na viwango vya kunyonya vimenukuliwa kwa asilimia.
B
Ukosefu (%) = —— × 100%
B0
B - kiwango cha kutokuwepo (au sampuli)
B0 --kupoteza kiwango cha sifuri
10.2 Mjiko wa Kawaida
----Ili kuchora mduara wa kawaida: Chukua thamani ya kunyonya ya viwango kama mhimili y, nusu logarithmic ya mkusanyiko wa suluhu ya viwango vya tylosin (ppb) kama mhimili wa x.
----Mkusanyiko wa tylosin wa kila sampuli (ppb), unaoweza kusomwa kutoka kwenye kipingo cha urekebishaji, unazidishwa na kipengele cha Dilution kinacholingana cha kila sampuli inayofuatwa, na mkusanyiko halisi wa sampuli hupatikana.
Tafadhali kumbuka:
programu maalum imetengenezwa kwa uchambuzi wa data, ambayo inaweza kutolewa kwa ombi.
11. Usikivu, usahihi na usahihi
Unyeti wa Jaribio:1.5ppb
Kikomo cha utambuzi:
Tishu za wanyama ………………………………………………1.5ppb Maziwa………………………………………………………..15ppb Usahihi:
Tishu za wanyama ……………………………………………
Maziwa…………………………………………………….80±10%
Usahihi:
Mgawo wa tofauti wa kit ELISA ni chini ya 10%.
12. Taarifa
12.1 Thamani za wastani za viwango vya kunyonya vilivyopatikana kwa viwango na sampuli zitapunguzwa ikiwa vitendanishi na sampuli hazijadhibitiwa kwa joto la kawaida (20-25℃).
12.2 Usiruhusu visima vidogo kukauka kati ya hatua ili kuepuka kuzaliana bila mafanikio na endesha hatua inayofuata mara baada ya kugonga kishikilia visima vidogo.
12.3 Tikisa kila kitendanishi taratibu kabla ya kutumia.
12.4 Weka ngozi yako mbali na kikomesha kwa kuwa ni 0.5MH2SO4suluhisho.
12.5 Usitumie vifaa vilivyopitwa na wakati.Usibadilishane vitendanishi vya bati tofauti, vinginevyo itapunguza usikivu.
12.6 Weka vifaa vya ELISA kwa 2-8℃, usigandishe.Ziba sahani ndogo za kupumzika, Epuka jua moja kwa moja wakati wa incubations zote.Inashauriwa kufunika sahani za microtiter.
12.7 Suluhisho la substrate linapaswa kuachwa ikiwa linageuka rangi.Vitendanishi vinaweza kuwa vibaya ikiwa thamani ya kunyonya (450/630nm) ya kiwango cha sifuri ni chini ya 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Mmenyuko wa rangi unahitaji dakika 15 baada ya kuongezwa kwa suluhisho A na suluhisho B. Na unaweza kuongeza muda wa muda wa incubation hadi 20min au zaidi ikiwa rangi ni nyepesi sana kuamua.Kamwe usizidi 30min, kinyume chake, fupisha muda wa incubation vizuri.
12.9 Joto bora la mmenyuko ni 37℃.Joto la juu au la chini litasababisha mabadiliko ya unyeti na maadili ya kunyonya.
13. Hifadhi
Hali ya uhifadhi: 2-8 ℃.
Muda wa kuhifadhi: miezi 12.
