Kompetitivní enzymová imunoanalýza pro kvantitativní analýzu tylosinu
Kompetitivní enzymová imunoanalýza Kit pro
Kvantitativní analýzaTylosin
1. Pozadí
Tylosinje makrolidové antibiotikum, které se používá především jako antibakteriální a antimykoplazma.Přísné MRL byly stanoveny, protože tento lék může u určitých skupin vést k závažným vedlejším účinkům.
Tato souprava je novým produktem založeným na technologii ELISA, která je rychlá, snadná, přesná a citlivá ve srovnání s běžnou instrumentální analýzou a potřebuje pouze 1,5 hodiny na jednu operaci, dokáže výrazně minimalizovat chyby obsluhy a náročnost práce.
2. Princip testu
Tato souprava je založena na nepřímé konkurenční technologii ELISA.Mikrotitrační jamky jsou potaženy vazebným antigenem.Tylosinový zbytek ve vzorku soutěží s antigenem potaženým na mikrotitrační destičce o protilátku.Po přidání enzymaticky značené protilátky se k zobrazení barvy použije substrát TMB.Absorbance vzorku je negativně úměrná množství tylosinu v něm obsaženém, po porovnání se standardní křivkou, vynásobené faktorem ředění, lze vypočítat množství rezidua tylosinu ve vzorku.
3. Aplikace
Tuto soupravu lze použít při kvantitativní a kvalitativní analýze reziduí tylosinu v živočišných tkáních (kuře, vepřové, kachní) a mléce, medu, vejcích atd.
4. Křížové reakce
Tylosin……………………………………………….. 100%
Tilmikosin………………………………………………………<2 %
5. Požadované materiály
5.1 Vybavení:
---- Mikrotitrační destičkový spektrofotometr (450nm/630nm)
---- Rotační výparník nebo nástroje na sušení dusíku
---- homogenizátor
----Shaker
----Odstředivka
----Analytická váha (indukčnost: 0,01g)
----Odměrná pipeta: 10ml
---- Gumová pipetová baňka
----Odměrná baňka: 10ml
---- Polystyrenové centrifugační zkumavky: 50ml
----Mikropipety: 20-200ml, 100-1000ml
250ml multipipeta
5.2 Činidla:
----Hydroxid sodný (NaOH, AR)
---- Hydrogenuhličitan sodný (NaHCO3,AR)
---- Uhličitan sodný (NaCO3, AR)
---- Kyselina trichloroctová (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Ethylacetát (AR)
┅┅n-Hexan (AR)
----Deionizovaná voda
6. Součásti sady
l Mikrotitrační destička s 96 jamkami potaženými antigenem
l Standardní roztoky (5 lahviček, 1ml/lahev)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Standardní kontrola dávkování: (1 ml/lahev)1 ppm
l Enzymový konjugát 1ml……………..…..…červené víčko
l Protilátkový roztok 7ml……………….……zelený uzávěr
l Roztok A 7ml……………………….….……bílý uzávěr
l Roztok B 7ml…………………………………..červený uzávěr
l Stop roztok 7ml.……………….……….žlutý uzávěr
l 20×koncentrovaný promývací roztok 40ml
…………………………………..…průhledný uzávěr
l 4×koncentrovaný extrakční roztok 50ml
……………………………………………….modrá čepice
7. Příprava činidel:
Řešení 1:0,1 mol/l roztoku NaOH
Navažte 0,4 g NaOH do 100 ml deionizované vody a zcela promíchejte.
Řešení 2: 1mol/l roztok NaOH
Navažte 4 g NaOH do 100 ml deionizované vody a zcela promíchejte.
Řešení 3: Uhličitanová pufrovací sůl
Řešení1: 0,2M PB
Rozpusťte 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O deionizovanou vodou a zřeďte na 1000 ml.
Řešení2: Extrakční roztok
2× koncentrovaný extrakční roztok nařeďte deionizovanou vodou v objemovém poměru 1:1(např. 10ml 2×extrakčního roztoku + 10ml deionizované vody), který bude použit pro extrakci vzorku,tento roztok lze skladovat při 4 °C po dobu 1 měsíce.
Řešení3: Promývací roztok
20× koncentrovaný promývací roztok nařeďte deionizovanou vodou v objemovém poměru 1:19(např. 5ml 20×promývacího roztoku + 95ml deionizované vody), který bude použit pro mytí talířů.Tento roztok lze skladovat při 4 °C po dobu 1 měsíce.
8. Přípravy vzorků
8.1 Upozornění a bezpečnostní opatření před provozem:
(a) V průběhu experimentu použijte jednorázové špičky a při absorbování jiného činidla je vyměňte.
(b) Ujistěte se, že všechny nástroje jsou čisté.
(c) Uchovávejte vzorek tkáně v mrazu.
(d) Připravený vzorek by měl být použit pro analýzu najednou.
8.2 Živočišná tkáň (kuřecí, vepřové atd.)
---- Homogenizujte vzorek homogenizátorem;
---- Odeberte 2,0 ± 0,05 g homogenátu do 50 ml polystyrenové centrifugační zkumavky;přidejte 2 ml 0,2M PB (řešení1), protřepejte do rozpuštění a poté přidejte 8 ml ethylacetátu a intenzivně třepejte 3 minuty;
----Odstředivka pro separaci: 3000g / okolní teplota / 5min.
---- Přeneste 4 ml supernatantu organické fáze do 10 ml skleněné zkumavky, vysušte ve vodní lázni o teplotě 50-60 °C pod proudem plynného dusíku;
---- Suchý zbytek rozpusťte v 1 ml n-hexanu, vortexujte 30 s, aby se rozpustil, a poté přidejte 1 ml extrakčního roztoku (řešení2), vortexujte 1 min.centrifuga pro separaci: 3000g / okolní teplota / 5min
---- Odstraňte supernatant n-hexanovou fázi;odeberte 50 μl substrátové vodné fáze pro analýzu.
Faktor ředění: 1
8.2 Mléko
---- Odeberte 100 μl vzorku syrového mléka, smíchejte s 900 μl extrakčního roztoku (řešení2) a zcela promíchejte.
---- Odeberte 50 μl připraveného roztoku pro stanovení.
Faktor ředění: 10
9. Proces testu
9.1 Upozornění před analýzou
9.1.1Ujistěte se, že všechna činidla a mikrojamky mají pokojovou teplotu (20-25 °C).
9.1.2Všechna zbývající činidla vraťte do 2-8℃ihned po použití.
9.1.3Správné promytí mikrojamek je důležitým krokem v procesu testu;je to zásadní faktor pro reprodukovatelnost analýzy ELISA.
9.1.4 Aběhem inkubace zhasněte světlo a zakryjte mikrojamky.
9.2 Kroky testu
9.2.1 Všechny reagencie vyjměte při pokojové teplotě (20-25℃) po dobu delší než 30 minut, před použitím jemně protřepejte.
9.2.2 Vyjměte potřebné mikrojamky a zbytek okamžitě vraťte do sáčku se zipem při 2-8 °C.
9.2.3 Zředěný promývací roztok by měl být před použitím znovu zahřát na pokojovou teplotu.
9.2.4Číslo:Každá pozice mikrojamek očíslovaná a všechny standardy a vzorky by měly být zpracovány v duplikátech.Zaznamenejte pozice standardů a vzorků.
9.2.5Add standardní roztok/vzorek a roztok protilátky: Přidejte 50 µl standardního roztoku ((sada poskytnuta)) nebo připravený vzorek do odpovídajících jamek.Přidejte 50 µl roztoku protilátky (sada poskytnuta).Jemně promíchejte ručním protřepáním destičky a inkubujte 30 minut při 37 °C s krytem.
9.2.6Umýt: Jemně odstraňte kryt a vyčistěte kapalinu z jamek a opláchněte mikrojamky 250 µl zředěného promývacího roztoku (řešení3) v intervalu 10s 4-5krát.Absorbujte zbytkovou vodu savým papírem (zbytkové vzduchové bubliny lze odstranit nepoužitou špičkou).
9.2.7Přidejte enzymový konjugát: Přidejte 100 ml roztoku enzymového konjugátu (sada poskytnuta) do každé jamky, jemně promíchejte a inkubujte 30 minut při 37 °C s krytem.Opakujte krok mytí znovu.
9.2.8Zbarvení: Přidejte 50 µl roztoku A(sada poskytnuta) a 50 µl roztoku B(sada poskytnuta) do každé studny.Jemně promíchejte a inkubujte 15 minut při 37 °C s krytem.
9.2.9Opatření: Přidejte 50 µl zastavovacího roztoku (sada poskytnuta) do každé studny.Jemně promíchejte a změřte absorbanci při 450 nm (doporučuje se měření s duální vlnovou délkou 450/630 nm. Výsledek odečtěte do 5 minut po přidání stop roztoku).
10. Výsledky
10.1 Procentní absorbance
Průměrné hodnoty hodnot absorbance získané pro standardy a vzorky se vydělí hodnotou absorbance prvního standardu (nulový standard ) a vynásobí se 100 %.Nulový standard se tedy rovná 100 % a hodnoty absorbance jsou uvedeny v procentech.
B
Absorbance (%) = —— ×100 %
B0
B ——absorbční standard (nebo vzorek)
B0 ——norma nulové absorbance
10.2 Standardní křivka
----K nakreslení standardní křivky: Vezměte hodnotu absorbance standardů jako osu y, semilogaritmickou koncentraci standardního roztoku tylosinu (ppb) jako osu x.
----Koncentrace tylosinu v každém vzorku (ppb), kterou lze odečíst z kalibrační křivky, se vynásobí odpovídajícím faktorem ředění každého sledovaného vzorku a získá se skutečná koncentrace vzorku.
Všimněte si prosím:
pro analýzu dat byl vyvinut speciální software, který může být poskytnut na vyžádání.
11. Citlivost, přesnost a preciznost
Citlivost testu:1,5 ppb
Detekční limit:
Živočišná tkáň……………………………………………… 1,5 ppb Mléko ……………………………………………………….. 15 ppb Přesnost:
Živočišná tkáň ………………………………………… 80±15 %
Mléko ………………………………………………….. 80±10 %
Přesnost:
Variační koeficient soupravy ELISA je menší než 10 %.
12. Upozornění
12.1 Střední hodnoty hodnot absorbance získané pro standardy a vzorky budou sníženy, pokud reagencie a vzorky nebyly regulovány na pokojovou teplotu (20-25 °C).
12.2 Nenechávejte mikrojamky mezi jednotlivými kroky zaschnout, abyste předešli neúspěšné reprodukovatelnosti, a další krok proveďte ihned po klepnutí na držák mikrojamek.
12.3 Před použitím každé činidlo jemně protřepejte.
12.4 Udržujte pokožku mimo dosah roztoku na zastavení, protože je 0,5 MHz2SO4řešení.
12.5 Nepoužívejte zastaralé soupravy.Nevyměňujte reagencie z různých šarží, jinak by se snížila citlivost.
12.6 Uchovávejte soupravy ELISA při 2-8 °C, nezmrazujte.Mikrotitrační destičky uzavřete, vyhněte se přímému slunečnímu záření během všech inkubací.Doporučuje se mikrotitrační destičky zakrýt.
12.7 Roztok substrátu by měl být opuštěn, pokud se barví.Reagencie se mohou zkazit, pokud je hodnota absorbance (450/630 nm) nulového standardu menší než 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Barevná reakce vyžaduje 15 minut po přidání roztoku A a roztoku B. A můžete prodloužit inkubační rozsahy na 20 minut nebo více, pokud je barva příliš světlá na to, aby bylo možné určit.Nikdy nepřekračujte 30min, naopak inkubační dobu řádně zkraťte.
12.9 Optimální reakční teplota je 37℃.Vyšší nebo nižší teplota povede ke změnám hodnot citlivosti a absorbance.
13. Skladování
Skladovací podmínky: 2-8℃.
Doba skladování: 12 měsíců.
