Konkurencyjny zestaw immunoenzymatyczny do analizy ilościowej tylozyny
Konkurencyjny zestaw immunoenzymatyczny do
Analiza ilościowaTylozyna
1. Tło
Tylozynajest antybiotykiem makrolidowym, stosowanym głównie jako środek przeciwbakteryjny i przeciwmykoplazmowy.Ścisłe MRL zostały ustalone, ponieważ ten lek może prowadzić do poważnych skutków ubocznych w niektórych grupach.
Ten zestaw jest nowym produktem opartym na technologii ELISA, która jest szybka, łatwa, dokładna i czuła w porównaniu ze zwykłą analizą instrumentalną i wymaga tylko 1,5 godziny w jednej operacji, może znacznie zminimalizować błąd operacji i intensywność pracy.
2. Zasada testu
Ten zestaw jest oparty na pośrednio-konkurencyjnej technologii ELISA.Studzienki do mikromiareczkowania powleka się antygenem sprzęgającym.Pozostałość tylozyny w próbce konkuruje z antygenem opłaszczonym na płytce do mikromiareczkowania o przeciwciało.Po dodaniu anty-przeciwciała znakowanego enzymem, do pokazania koloru stosuje się substrat TMB.Absorbancja próbki jest ujemnie związana z obecnością w niej tylozyny, po porównaniu z krzywą standardową pomnożoną przez współczynnik rozcieńczenia można obliczyć ilość pozostałości tylozyny w próbce.
3. Aplikacje
Zestaw ten może być wykorzystany do ilościowej i jakościowej analizy pozostałości tylozyny w tkankach zwierzęcych (kurczak, wieprzowina, kaczka) oraz mleku, miodzie, jajach itp.
4. Reakcje krzyżowe
Tylozyna………………………..100%
Tylmikozyna……………………<2%
5. Wymagane materiały
5.1 Wyposażenie:
---- Spektrofotometr do płytek mikrotitracyjnych (450nm/630nm)
---- Parownik obrotowy lub instrumenty do suszenia azotem
----homogenizator
----Wibrator
----Odwirować
---- waga analityczna (indukcyjność: 0.01g)
---- Pipeta z podziałką: 10 ml
---- Gumowa gruszka do pipety
---- Kolba miarowa: 10 ml
---- Polistyrenowe probówki wirówkowe: 50 ml
----Mikropipety: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-wielipipeta
5.2 Odczynniki:
----Wodorotlenek sodu (NaOH, AR)
---- Wodorowęglan sodu (NaHCO3,AR)
---- Węglan sodu (NaCO3, AR)
----Kwas trichlorooctowy (AR)
---- Acetonitryl (AR)
---- Octan etylu (AR)
┅┅n-heksan (AR)
----Dejonizowana woda
6. Elementy zestawu
l Płytka do mikromiareczkowania z 96 studzienkami opłaszczonymi antygenem
l standardowe roztwory (5 butelek, 1 ml/butelka)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Standardowa kontrola wzbogacania: (1 ml/butelkę)1ppm
l Koniugat enzymu 1ml……………..…..…czerwona nakrętka
l Roztwór przeciwciał 7ml……………….……zielona nakrętka
l Roztwór A 7ml…………………….….……biała zakrętka
l Roztwór B 7ml………………………………..czerwona zakrętka
l Roztwór zatrzymujący 7ml.……………….……….żółta zakrętka
l 20×stężony roztwór do płukania 40ml
…………………………………..…przezroczysta nasadka
l 4×stężony roztwór ekstrakcyjny 50ml
……………………………………………….niebieska czapka
7. Przygotowanie odczynników:
Rozwiązanie 1:0,1 mola/l roztworu NaOH
Odważyć 0,4 g NaOH do 100 ml dejonizowanej wody i dokładnie wymieszać.
Rozwiązanie 2: 1mol/l roztworu NaOH
Odważyć 4 g NaOH do 100 ml dejonizowanej wody i dokładnie wymieszać.
Rozwiązanie 3: Sól buforowa węglanowa
Rozwiązanie1: 0,2 M PB
Rozpuścić 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O wodą dejonizowaną i rozcieńczyć do 1000 ml.
Rozwiązanie2: Roztwór do ekstrakcji
Rozcieńczyć 2×stężony roztwór ekstrakcyjny wodą dejonizowaną w stosunku objętościowym 1:1 (np. 10ml 2×roztworu ekstrakcyjnego + 10ml wody dejonizowanej), które zostaną użyte do ekstrakcji próbki,ten roztwór można przechowywać w temperaturze 4 ℃ przez 1 miesiąc.
Rozwiązanie3: Roztwór do płukania
Rozcieńczyć 20×stężony roztwór do płukania wodą dejonizowaną w stosunku objętościowym 1:19 (np. 5 ml 20×roztworu do płukania + 95 ml wody dejonizowanej), który posłuży do mycia talerzy.Ten roztwór można przechowywać w temperaturze 4 ℃ przez 1 miesiąc.
8. Przygotowanie próbek
8.1 Uwaga i środki ostrożności przed uruchomieniem:
(a) Proszę używać jednorazowych końcówek w trakcie eksperymentu i zmieniać końcówki, gdy absorbują inny odczynnik.
(b) Upewnij się, że wszystkie instrumenty są czyste.
(c) Przechowywać próbkę tkanki w zamrażarce.
(d) Przygotowaną próbkę należy od razu wykorzystać do oznaczenia.
8.2 Tkanki zwierzęce (kurczak, wieprzowina itp.)
---- Homogenizuj próbkę za pomocą homogenizatora;
----Wziąć 2,0 ± 0,05 g homogenatu do 50 ml polistyrenowej probówki wirówkowej;dodać 2 ml 0,2 M PB (rozwiązanie1), wstrząsnąć do rozpuszczenia, a następnie dodać 8 ml octanu etylu i energicznie wstrząsać przez 3 minuty;
----Wirówka do separacji: 3000g / temperatura otoczenia / 5min.
---- Przenieść 4 ml supernatantu fazy organicznej do 10 ml szklanej probówki, wysuszyć łaźnią wodną o temperaturze 50-60 ℃ w strumieniu gazowego azotu;
---- Rozpuścić suche pozostałości za pomocą 1 ml n-heksanu, worteksować przez 30 sekund w celu rozpuszczenia, a następnie dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego (rozwiązanie2), worteksować przez 1 min.wirówka do separacji: 3000g / temperatura otoczenia / 5min
----Usunąć supernatant fazę n-heksanową;pobrać 50 μl fazy wodnej substratu do analizy.
Współczynnik rozcieńczenia: 1
8.2 Mleko
---- Weź 100 μl próbki surowego mleka, wymieszaj z 900 μl roztworu ekstrakcyjnego (rozwiązanie2) i dokładnie wymieszaj.
----Pobierz 50 μl przygotowanego roztworu do testu.
Współczynnik rozcieńczenia: 10
9. Proces testowy
9.1 Uwaga przed testem
9.1.1Upewnij się, że wszystkie odczynniki i mikrostudzienki mają temperaturę pokojową (20-25℃).
9.1.2Odwróć wszystkie pozostałe odczynniki do 2-8℃natychmiast po użyciu.
9.1.3Prawidłowe płukanie mikrodołków jest ważnym krokiem w procesie oznaczania;jest to istotny czynnik powtarzalności analizy ELISA.
9.1.4 Ausuń światło i przykryj mikrostudzienki podczas inkubacji.
9.2 Etapy testu
9.2.1 Wyjmij wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej (20-25℃) na ponad 30 minut, delikatnie wstrząśnij przed użyciem.
9.2.2 Wyjmij potrzebne mikrodołki i natychmiast włóż resztę do torebki strunowej w temperaturze 2-8 ℃.
9.2.3 Przed użyciem rozcieńczony roztwór do przemywania należy ponownie ogrzać do temperatury pokojowej.
9.2.4Numer:Ponumerowane pozycje każdej mikrostudzienki, a wszystkie wzorce i próbki należy analizować w dwóch powtórzeniach.Zanotuj pozycje wzorców i próbek.
9.2.5Add standardowy roztwór/próbka i roztwór przeciwciała: Dodaj 50 µl roztworu wzorcowego ((dostarczony zestaw)) lub przygotowaną próbkę do odpowiednich dołków.Dodaj 50 µl roztworu przeciwciał (dostarczony zestaw).Delikatnie wymieszać poprzez ręczne potrząsanie płytką i inkubować przez 30 min w temperaturze 37℃ pod przykryciem.
9.2.6Myć się: Delikatnie zdejmij pokrywę i oczyść płyn z dołków i przepłucz mikrodołki 250 µl rozcieńczonego roztworu do płukania (rozwiązanie3) w odstępie 10 sekund przez 4-5 razy.Zaabsorbuj pozostałą wodę papierem chłonnym (pozostałe pęcherzyki powietrza można usunąć nieużywaną końcówką).
9.2.7Dodać koniugat enzymu: Dodaj 100 ml roztworu koniugatu enzymu (dostarczony zestaw) do każdego dołka, delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 min w 37℃ pod przykryciem.Powtórz krok prania ponownie.
9.2.8Ubarwienie: Dodać 50 µl roztworu A(dostarczony zestaw) i 50 µl roztworu B (dostarczony zestaw) do każdego dołka.Delikatnie wymieszać i inkubować przez 15 min w 37℃ pod przykryciem.
9.2.9Mierzyć: Dodaj 50 µl roztworu zatrzymującego (dostarczony zestaw) do każdego dołka.Delikatnie wymieszaj i zmierz absorbancję przy 450nm (zaleca się pomiar przy podwójnej długości fali 450/630nm. Odczytaj wynik w ciągu 5 minut po dodaniu roztworu zatrzymującego).
10. Wyniki
10,1 Procent absorbancji
Średnie wartości absorbancji otrzymane dla wzorców i próbek dzieli się przez wartość absorbancji pierwszego wzorca (standard zerowy) i mnoży przez 100%.Standard zerowy jest zatem równy 100%, a wartości absorbancji są podawane w procentach.
B
Absorbancja (%) = —— ×100%
B0
B — — wzorzec absorbancji (lub próbka)
B0 ——wzorzec zerowej absorpcji
10.2 Krzywa standardowa
----Aby narysować krzywą wzorcową: Przyjmij wartość absorbancji wzorców jako oś y, półlogarytmiczną ze stężenia roztworu wzorcowego tylozyny (ppb) jako oś x.
---- Stężenie tylozyny w każdej próbce (ppb), które można odczytać z krzywej kalibracji, mnoży się przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia każdej próbki i uzyskuje się rzeczywiste stężenie próbki.
Proszę zauważyć:
do analizy danych opracowano specjalne oprogramowanie, które może być dostarczone na żądanie.
11. Czułość, dokładność i precyzja
Czułość testu:1,5 ppb
Granica wykrywalności:
Tkanka zwierzęca………………………….……………1,5 ppb Mleko………………………..15 ppb Precyzja:
Tkanka zwierzęca…………………………...…………80±15%
Mleko…………………………………..……….……80±10%
Precyzja:
Współczynnik zmienności zestawu ELISA jest mniejszy niż 10%.
12. Uwaga
12.1 Średnie wartości absorbancji otrzymane dla wzorców i próbek zostaną obniżone, jeśli odczynniki i próbki nie zostaną doprowadzone do temperatury pokojowej (20-25℃).
12.2 Nie dopuścić do wyschnięcia mikrostudzienek między kolejnymi etapami, aby uniknąć nieudanej odtwarzalności, i przejść do następnego etapu natychmiast po dotknięciu uchwytu mikrostudzienek.
12.3 Delikatnie wstrząsnąć każdym odczynnikiem przed użyciem.
12.4 Trzymaj skórę z dala od roztworu zatrzymującego, ponieważ wynosi on 0,5 MHz2SO4rozwiązanie.
12.5 Nie używaj przeterminowanych zestawów.Nie wymieniaj odczynników z różnych partii, bo spowoduje to spadek czułości.
12.6 Przechowuj zestawy ELISA w temperaturze 2-8 ℃, nie zamrażaj.Uszczelnij pozostałe płytki z mikrostudzienkami. Unikaj bezpośredniego światła słonecznego podczas wszystkich inkubacji.Zaleca się przykrywanie płytek do mikromiareczkowania.
12.7 Roztwór podłoża należy porzucić, jeśli zmieni kolor.Odczynniki mogą ulec zepsuciu, jeśli wartość absorbancji (450/630nm) wzorca zerowego jest mniejsza niż 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Reakcja zabarwienia wymaga 15 minut po dodaniu roztworu A i roztworu B. Można wydłużyć zakresy czasu inkubacji do 20 minut lub więcej, jeśli kolor jest zbyt jasny, aby można go było określić.Nigdy nie przekraczaj 30 min, wręcz przeciwnie, odpowiednio skróć czas inkubacji.
12.9 Optymalna temperatura reakcji wynosi 37℃.Wyższa lub niższa temperatura spowoduje zmianę wartości czułości i absorbancji.
13. Przechowywanie
Warunki przechowywania: 2-8 ℃.
Okres przechowywania: 12 miesięcy.
