Kit de imunotest enzimatic competitiv pentru analiza cantitativă a tilozinei
Kit de imunotest enzimatic competitiv pentru
Analiza cantitativă aTilozina
1. Fundal
Tilozinaeste un antibiotic macrolid, care se aplică în principal ca antibacterian și anti-micoplasmă.Au fost stabilite LMR stricte, deoarece acest medicament poate duce la efecte secundare grave în anumite grupuri.
Acest kit este un produs nou bazat pe tehnologia ELISA, care este rapid, ușor, precis și sensibil în comparație cu analiza instrumentală obișnuită și necesită doar 1,5 ore într-o singură operațiune, poate minimiza considerabil eroarea de funcționare și intensitatea muncii.
2. Principiul testului
Acest kit se bazează pe tehnologia ELISA indirect-competitivă.Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu antigen de cuplare.Reziduul de tilozină din probă concurează cu antigenul acoperit pe placa de microtitrare pentru anticorp.După adăugarea de anticorpi marcați cu enzimă, substratul TMB este utilizat pentru a arăta culoarea.Absorbția probei este legată negativ de reziduul de tilozină din ea, după compararea cu curba standard, înmulțită cu factorul de diluție, se poate calcula cantitatea de reziduuri de tilozină din probă.
3. Aplicații
Acest kit poate fi utilizat în analiza cantitativă și calitativă a reziduurilor de tilozină din țesutul animal (pui, porc, rață) și lapte, miere, ou etc.
4. Reacții încrucișate
Tilozina………………………………………………………..100%
Tilmicosin ………………………………………………………<2%
5. Materiale necesare
5.1 Echipamente:
---- Spectrofotometru cu placă de microtitrare (450nm/630nm)
----Evaporator rotativ sau instrumente de uscare cu azot
----omogenizator
----Agitator
----Centrifuga
----Balanta analitica (inductanta: 0,01 g)
----Pipeta gradata: 10ml
----Bec pipetă din cauciuc
----Balon cotat: 10ml
----Tuburi de centrifuga din polistiren: 50ml
----Micropipete: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multippette
5.2 Reactivi:
----Hidroxid de sodiu (NaOH, AR)
---- Bicarbonat de sodiu (NaHCO3,AR)
---- Carbonat de sodiu (NaCO3, AR)
----Acid tricloroacetic (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Acetat de etil (AR)
┅┅n-hexan (AR)
----Apă deionizată
6. Componentele trusei
l Placă de microtitrare cu 96 de godeuri acoperite cu antigen
l Soluții standard (5 sticle, 1 ml/sticlă)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Control standard de împingere: (1 ml/sticlă)1 ppm
l Conjugat enzimatic 1ml……………..…..…cap roșu
l Soluție de anticorpi 7ml……….……capac verde
l Soluție A 7ml…………….….……capac alb
l Soluția B 7ml………………………………..capac roșu
l Soluție stop 7ml……………….……….capac galben
l 20×soluție de spălare concentrată 40ml
…………………………………………..…capac transparent
l 4×soluție de extracție concentrată 50ml
……………………………………………………….șapcă albastră
7. Prepararea reactivilor:
Soluția 1:0,1 mol/L soluție de NaOH
Se cântăresc 0,4 g NaOH la 100 ml apă deionizată și se amestecă complet.
Soluția 2: 1mol/L soluție de NaOH
Se cântăresc 4 g NaOH la 100 ml apă deionizată și se amestecă complet.
Soluția 3: Sare tampon carbonat
Soluţie1: 0,2 M PB
Se dizolvă 51,6 g de Na2HPO4·12H2O, 8,7 g de NaH2PO4·2H2O cu apă deionizată și se diluează la 1000 ml.
Soluţie2: Soluție de extracție
Se diluează soluția de extracție 2x concentrată cu apă deionizată în raportul de volum de 1:1(de ex. 10ml de soluție de extracție 2x + 10ml de apă deionizată), care va fi folosit pentru extragerea probei,această soluție poate fi păstrată la 4℃ timp de 1 lună.
Soluţie3: Soluție de spălare
Se diluează soluția de spălare concentrată de 20 x cu apă deionizată în raport de volum de 1:19(de exemplu 5 ml de soluție de spălare 20× + 95 ml de apă deionizată), care va fi folosit pentru spălarea farfuriilor.Această soluție poate fi păstrată la 4℃ timp de 1 lună.
8. Prepararea probelor
8.1 Notă și precauții înainte de utilizare:
(a) Vă rugăm să utilizați vârfuri unice în procesul de experiment și să schimbați vârfurile atunci când absorbiți reactiv diferit.
(b) Asigurați-vă că toate instrumentele sunt curate.
(c) Păstrați proba de țesut în congelare.
(d) Proba pregătită trebuie utilizată pentru analiză imediat.
8.2 Țesut animal (pui, porc etc.)
----Omogenizeaza proba cu omogenizator;
----Se iau 2,0±0,05 g de omogenat într-un tub de centrifugă de polistiren de 50 ml;adăugați 2 ml de 0,2 M PB (soluţie1), se agită pentru a se dizolva, apoi se adaugă 8 ml de acetat de etil și se agită puternic timp de 3 minute;
----Centrifuga pentru separare: 3000g/temperatura ambianta/5min.
----Se transferă 4 ml din faza organică supernatantă într-un tub de sticlă de 10 ml, se usucă cu o baie de apă la 50-60℃ sub curent de azot gazos;
---- Dizolvați resturile uscate cu 1 ml de n-hexan, agitați timp de 30 de secunde pentru a se dizolva și apoi adăugați 1 ml de soluție de extracție (soluţie2), agitați timp de 1 min.centrifuga pentru separare: 3000g / temperatura ambianta / 5min
----Se îndepărtează faza n-hexan supernatant;luați 50μl din faza apoasă de substrat pentru analiză.
Factorul de diluție: 1
8.2 Lapte
----Luați 100μl de probă de lapte crud, amestecați cu 900μl de soluție de extracție (soluţie2) și amestecați complet.
----Luați 50μl din soluția preparată pentru analiză.
Factor de diluție: 10
9. Procesul de testare
9.1 Notificare înainte de analiză
9.1.1Asigurați-vă că toți reactivii și microgodeurile sunt toate la temperatura camerei (20-25℃).
9.1.2Readuceți toți restul reactivi la 2-8℃imediat după utilizare.
9.1.3Spălarea corectă a microgodeurilor este un pas important în procesul de analiză;este factorul vital pentru reproductibilitatea analizei ELISA.
9.1.4 Agoliți lumina și acoperiți microgodeurile în timpul incubației.
9.2 Etape de testare
9.2.1 Scoateți toți reactivii la temperatura camerei (20-25℃) pentru mai mult de 30 de minute, agitați ușor înainte de utilizare.
9.2.2 Scoateți microgodeurile necesare și returnați restul în punga cu fermoar la 2-8℃ imediat.
9.2.3 Soluția de spălare diluată trebuie reîncălzită pentru a fi la temperatura camerei înainte de utilizare.
9.2.4Număr:Numerotate fiecare poziție de microgodeuri și toate standardele și probele trebuie să fie executate în dublu exemplar.Înregistrați standardele și pozițiile mostrelor.
9.2.5Add soluție standard/probă și soluție de anticorpi: Adăugați 50 µl de soluție standard((trusa furnizata)) sau eșantion pregătit la godeurile corespunzătoare.Adăugați 50 µl de soluție de anticorpi (trusa furnizata).Se amestecă ușor agitând placa manual și se incubează timp de 30 de minute la 37℃ cu capac.
9.2.6Spalare: Îndepărtați ușor capacul și curățați lichidul din godeuri și clătiți microgodeurile cu 250 µl soluție de spălare diluată (soluţie3) la interval de 10s de 4-5 ori.Se absoarbe apa reziduală cu hârtie absorbantă (bulla de aer rămasă poate fi eliminată cu vârful nefolosit).
9.2.7Adăugați conjugatul enzimatic: Adăugați 100 ml de soluție de conjugat enzimatic (trusa furnizata) în fiecare godeu, amestecați ușor și incubați timp de 30 de minute la 37 ℃ cu capac.Repetați etapa de spălare din nou.
9.2.8Colorare: Adăugați 50 µl de soluție A(trusa furnizata) și 50µl de soluție B(trusa furnizata) la fiecare put.Se amestecă ușor și se incubează timp de 15 minute la 37℃ cu capac.
9.2.9Măsura: Adăugați 50 µl de soluție stop (trusa furnizata) la fiecare put.Se amestecă ușor și se măsoară absorbanța la 450 nm (se recomandă măsurarea cu lungimea de undă duală de 450/630 nm. Citiți rezultatul în 5 minute după adăugarea soluției de oprire).
10. Rezultate
10.1 Absorbanță procentuală
Valorile medii ale valorilor absorbanței obținute pentru standarde și probe sunt împărțite la valoarea absorbanței primului standard (standard zero) și înmulțite cu 100%.Standardul zero se face astfel egal cu 100% iar valorile absorbanței sunt exprimate în procente.
B
Absorbanța (%) = —— ×100%
B0
B ——standard de absorbție (sau eșantion)
B0 ——absorbanță zero standard
10.2 Curba standard
----Pentru a desena o curbă standard: Luați valoarea absorbanței standardelor ca axa y, semi-logaritmică a concentrației soluției standard de tilozină (ppb) ca axa x.
----Concentrația de tilozină a fiecărei probe (ppb), care poate fi citită din curba de calibrare, este înmulțită cu factorul de diluție corespunzător al fiecărei probe urmărite și se obține concentrația reală a probei.
Vă rugăm să observați:
a fost dezvoltat un software special pentru analiza datelor, care poate fi furnizat la cerere.
11. Sensibilitate, acuratețe și precizie
Sensibilitatea testului:1,5 ppb
Limita detectiei:
Țesut animal…………………………………………1,5 ppb Lapte……………………………………………………………………..15ppb Precizie:
Țesut animal……………………………………80±15%
Lapte………………………………………..……….……80±10%
Precizie:
Coeficientul de variație al trusei ELISA este mai mic de 10%.
12. Observare
12.1 Valorile medii ale valorilor absorbantei obtinute pentru standarde si probe vor fi reduse daca reactivii si probele nu au fost reglate la temperatura camerei (20-25℃).
12.2 Nu lăsați microgodeurile să se usuce între pași pentru a evita reproductibilitatea nereușită și operați pasul următor imediat după atingerea suportului pentru microgodeuri.
12.3 Agitați ușor fiecare reactiv înainte de utilizare.
12.4 Țineți-vă pielea departe de soluția de oprire pentru că este de 0,5MH2SO4soluţie.
12.5 Nu utilizați kiturile învechite.Nu schimbați reactivii din diferite loturi, altfel va scădea sensibilitatea.
12.6 Păstrați kiturile ELISA la 2-8℃, nu le înghețați.Sigilați plăcile de microgodeuri în repaus, evitați lumina directă a soarelui în timpul tuturor incubațiilor.Se recomandă acoperirea plăcilor de microtitrare.
12.7 Soluția de substrat trebuie abandonată dacă își schimbă culoarea.Reactivii se pot înrăutăți dacă valoarea absorbanței (450/630nm) a standardului zero este mai mică de 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Reacția de colorare are nevoie de 15 minute după adăugarea soluției A și a soluției B. Și puteți prelungi intervalele de timp de incubare la 20 de minute sau mai mult dacă culoarea este prea deschisă pentru a fi determinată.Nu depășiți niciodată 30 de minute, dimpotrivă, scurtați în mod corespunzător timpul de incubare.
12.9 Temperatura optimă de reacție este de 37℃.Temperatura mai mare sau mai scăzută va duce la modificări ale valorilor de sensibilitate și absorbanță.
13. Depozitare
Condiții de depozitare: 2-8℃.
Perioada de depozitare: 12 luni.
