cynnyrch

1. 1 .Cefndir

Mae nitrofurans yn wrthfiotigau sbectrwm eang synthetig, a ddefnyddir yn aml mewn cynhyrchu anifeiliaid oherwydd ei briodweddau gwrthfacterol a ffarmacocinetig rhagorol.Roeddent hefyd wedi cael eu defnyddio fel hyrwyddwyr twf mewn cynhyrchu moch, dofednod a dyfrol.Mewn astudiaethau hirdymor gydag anifeiliaid labordy, dangosodd y rhiant-gyffuriau a'u metabolion nodweddion carcinogenig a mwtagenig.Mae hyn wedi arwain at wahardd nitrofurans ar gyfer trin anifeiliaid a ddefnyddir i gynhyrchu bwyd.Cafodd y cyffuriau nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin a nitrofurazone eu gwahardd rhag cael eu defnyddio wrth gynhyrchu bwyd anifeiliaid yn yr UE ym 1993, a gwaharddwyd defnyddio furazolidone ym 1995.

Mae angen i'r dadansoddiad o weddillion cyffuriau nitrofuran fod yn seiliedig ar ganfod metabolion meinwe rhwymedig y rhiant-gyffuriau nitrofuran.Gan fod y rhiant-gyffuriau yn cael eu metaboli'n gyflym iawn, a bydd y metabolion nitrofuran sydd wedi'u rhwymo â meinwe yn cadw am amser hir, defnyddir y metabolion hyn fel y targed ar gyfer canfod cam-drin nitrofurans, sy'n cynnwys metabolyn Furazolidone (AOZ), metabolyn Furaltadone (AMOZ). ), metabolit Nitrofurantoin (AHD) a metabolit Nitrofurazone (SEM).

Mae gweddillion AOZ yn cael eu pennu gan amlaf gan LC-MS neu LC-MS/MS.Mae profion imiwn ensymau, o'u cymharu â dulliau cromatograffig, yn dangos manteision sylweddol o ran sensitifrwydd, terfyn canfod, offer technegol a gofyniad amser.(Cost amser: 45 munud)

1. 2 .Prawf Egwyddor

Mae'r pecyn ELISA hwn wedi'i gynllunio i ganfod AOZ yn seiliedig ar yr egwyddor o immunoassay ensymau cystadleuol anuniongyrchol.Mae'r ffynhonnau microtiter wedi'u gorchuddio ag antigen dal sy'n gysylltiedig â BSA.Mae AOZ yn y sampl yn cystadlu â'r antigen wedi'i orchuddio ar y plât microteitr ar gyfer y gwrthgorff a ychwanegwyd.Ar ôl ychwanegu ensym conjugate, defnyddir swbstrad cromogenig a mesurir y signal gan sbectroffotomedr.Mae'r amsugniad mewn cyfrannedd gwrthdro â'r crynodiad AOZ yn y sampl.

1. 3.Ceisiadau

Gellir defnyddio'r pecyn hwn mewn dadansoddiad meintiol ac ansoddol o weddillion AOZ ynmeinweoedd anima(cyhyr, afu ac ati), mêl.

1. 4.Traws-adweithiau

Metabolit Furazolidone (AOZ)……………………..100%

Metabolit Furaltadone (AMOZ)……………………<0.1%

Metabolit nitrofurantoin (AHD)…………………<0.1%

Metabolit nitrofurazone (SEM)…………………...<0.1%

Furazolidone…………………………………….…..…16.3%

Furaltadone………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Deunyddiau Angenrheidiol

5.1Offer

---- sbectrophotometer plât microtiter (450nm / 630nm)

---- Anweddydd Rotari neu offerynnau sychu nitrogen

---- Homogenizer / stumog

---- Ysgwydwr

---- Cymysgydd Vortex

----Centrifuge

---- Cydbwysedd dadansoddol (anwythiad: 0.01g)

---- Pibed graddedig: 10ml

---- Bwlb pibed rwber

---- Fflasg swmpus: 100ml

---- Fflasg wydr: 10ml

---- Tiwb centrifuge polystyren: 2ml, 50ml

---- Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-lluosog

5.2Adweithyddion

---- asetad ethyl (AR)

---- n-hecsan (neu n-heptane) (AR)

---- Dipotasiwm hydrogen ffosffad trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Asid hydroclorig crynodedig (HCl, AR)

-----Methanol

---- Sodiwm hydrocsid (NaOH, AR)

---- Dŵr Deionized

1. 6.Cydrannau Kit

l Plât microtiter wedi'i orchuddio ag antigen, 96 ffynnon

l Atebion safonol (6 potel, 1ml / potel)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Rheolaeth safonol sbeicio: (1ml/potel)........100ppb

l Cyfuniad ensym crynodedig 1ml...…..cap coch

l Diliwyddion ensymau cyfun 10ml……..cap gwyrdd

l Swbstrad A 7ml………....................cap gwyn

l Swbstrad B 7ml………........................cap coch

l Toddiant atal 7ml…………………………… cap melyn

l toddiant golchi crynodedig 20 × 40ml

…………………………………….……cap tryloyw

l 2 × toddiant echdynnu crynodedig 60ml….cap glas

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………cap gwyn

1. 7.Paratoi Adweithyddion

Ateb 1: adweithydd deilliadol:

Ychwanegu 10ml o fethanol at y botel gyda 2-Nitrobenzaldehyde a hydoddi.(ar y crynodiad o 10mM).

Ateb 2: 0.1MK₂HPO₄datrysiad:

Pwyswch 22.8g K₂HPO₄.3H₂O i 1L o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio i hydoddi.

Ateb 3: 1M ateb HCl

Hydoddwch 8.3ml Asid hydroclorig crynodedig gyda dŵr deionized i 100ml.

Ateb 4:Ateb NaOH 1M

Hydoddwch 4g NaOH gyda 100ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio.

Ateb 5: ateb echdynnu:

Gwanhau hydoddiant echdynnu crynodedig 2 × gyda dŵr wedi'i ddadïoneiddio yn y gymhareb cyfaint o 1:1.Gellir cadw'r datrysiad hwn am 1 mis ar 4 ℃, a fydd yn cael ei ddefnyddio i dynnu samplau.

Ateb 6: ateb golchi:

Gwanhewch yr hydoddiant golchi crynodedig 20 × â dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio yn y dogn cyfaint o 1:19, a ddefnyddir i olchi'r platiau.Gellir cadw'r hydoddiant gwanedig hwn am 1 mis ar 4 ℃.

1. 8.Paratoadau Sampl

8.1Hysbysiad a rhagofalon cyn gweithredu:

a) Defnyddiwch awgrymiadau untro yn yr arbrawf, a newidiwch y cynghorion wrth amsugno gwahanol adweithydd.

b) Sicrhewch fod yr holl offer arbrofol yn lân.

c) gellir cadw'r adweithydd deilliadol ar 2-8 ℃ am dri mis;

d) Gellir cadw'r hydoddiant HCl ar dymheredd ystafell am 3 mis;

e) Gellir cadw'r ateb NaOH am 3 mis ar dymheredd ystafell;

f) Cadw samplau heb eu trin yn rhewi (-20 ℃);

g) Gellir cadw samplau wedi'u trin am 24 awr ar 2-8 ℃ mewn tywyllwch.

8.2 Samplau meinwe anifeiliaid ac afu:

---- Homogenize y samplau gyda homogenizer;

---- Pwysau 1.0 ± 0.05g o'r sampl meinwe homogenedig i mewn i diwb centrifuge polystyren 50ml.Ychwanegwch 4ml o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio, hydoddiant HCl 0.5ml 1M ac adweithydd deilliadol 100ul (gweler hydoddiant 1).Ysgwydwch ef am 2 funud.

---- Deori ar 37 ℃ dros nos (tua 16h);

---- Ychwanegu 5ml 0.1MK₂HPO₄ (ateb2), 0.4ml 1M NaOH (ateb4) a 5ml asetad ethyl.Ysgwyd yn ffyrnig am 30s;

---- Centrifuge ar dymheredd ystafell (20-25 ℃) am 10 munud, o leiaf 3000g;

---- Cymerwch 2.5ml o'r cyfnod organig supernatant i mewn i diwb gwydr glân 10ml, sych gyda 50-60 ℃ nwy nitrogen neu anweddydd cylchdro;

---- Toddwch y bwyd dros ben sych gyda 1ml n-hecsan (neu n- heptane), fortecs am 30au, ychwanegu hydoddiant echdynnu 1ml (ateb5), fortecs 1min, cymysgu'n llwyr.

---- Centrifuge ar dymheredd ystafell (20-25^oC) am 5 munud, o leiaf 3000g;

---- Tynnwch y cyfnod organig supernatant;cymryd 50μl o'r cyfnod dŵr swbstrad ar gyfer assay.

8.4 Mêl

---- pwyso 1.0 ±0.05g o'r sampl mêl homogenaidd i mewn i diwb allgyrchu polystyren 50ml;

---- Ychwanegu 4ml o ddŵr deionized, 0.5ml 1M HCl (ateb3) ac adweithydd deilliadol 100μl (ateb1);ysgwyd yn gyfan gwbl am 2 funud;

---- Deor ar 37 ℃ dros nos (tua 16h);

---- Ychwanegu 5ml 0.1MK₂HPO₄ (ateb2), 0.4ml 1M NaOH (ateb4) a 5ml asetad ethyl, ysgwyd yn ffyrnig am 30s;

---- Centrifuge ar dymheredd ystafell (20-25 ℃) am 10 munud, o leiaf 3000g;

---- Cymerwch 2.5ml o'r cyfnod organig supernatant i mewn i diwb gwydr glân 10ml, sych gyda 50-60 ℃ nwy nitrogen neu anweddydd cylchdro;

---- Toddwch y bwyd dros ben sych gyda 1ml n-hecsan (neu n- heptane), fortecs am 30au, ychwanegwch hydoddiant echdynnu 1ml (ateb5), fortecs 1min, cymysgu'n llwyr.

---- Centrifuge ar dymheredd ystafell (20-25^oC) am 10 munud, o leiaf 3000g;

---- Cael gwared ar y cyfnod organig supernatant;cymryd 50μl o'r cyfnod dŵr swbstrad ar gyfer assay.

1. 9.Proses Assay

9.1Hysbysiad cyn assay

9.1.1 Sicrhewch fod yr holl adweithyddion a microffynnon i gyd ar dymheredd ystafell (20-25 ℃).

9.1.2 Dychwelwch yr holl adweithyddion gweddill i 2-8 ℃ yn syth ar ôl eu defnyddio.

9.1.3 Mae golchi'r microwells yn gywir yn gam pwysig yn y broses o assay;dyma'r ffactor hanfodol i atgynhyrchu dadansoddiad ELISA.

9.1.4 Osgowch y golau a gorchuddiwch y microwells yn ystod y cyfnod magu.

9.2 Camau Profi

9.2.1 Tynnwch yr holl adweithyddion allan ar dymheredd ystafell (20-25 ℃) am fwy na 30 munud, homogenize cyn ei ddefnyddio.

9.2.2 Cael y microwells sydd eu hangen allan a dychwelyd y gweddill i'r bag clo sip ar 2-8 ℃ ar unwaith.

9.2.3 Dylid ailgynhesu'r hydoddiant golchi crynodedig a'r hydoddiant echdynnu crynodedig i fod ar dymheredd ystafell cyn ei ddefnyddio.

9.2.4Rhif:Wedi'i rifo bob safle microwell a dylid rhedeg pob safon a sampl yn ddyblyg.Cofnodwch y safonau a safleoedd samplau.

9.2.5Gwanhau hydoddiant gwrthgyrff crynodedig: gwanhau'r hydoddiant ensym crynodedig gyda gwanedyddion cyfun ensym yn y gymhareb cyfaint o 1:10(1 plyg hydoddiant ensym crynodedig: 10 folds ensymau conjugate deluents).

9.2.6Ychwanegu hydoddiant safonol / sampl a hydoddiant cyfun ensymau: ychwanegu 50µl o hydoddiant safonol neu sampl wedi'i baratoi at ffynhonnau cyfatebol, ychwanegu 50µl hydoddiant cyfuniad ensym.Cymysgwch yn ysgafn trwy ysgwyd y plât â llaw a deorwch am 30 munud ar 25 ℃ gyda gorchudd.

9.2.7Golchwch: Tynnwch y clawr yn ysgafn ac arllwyswch yr hylif allan o'r ffynhonnau a rinsiwch y microwells gyda hydoddiant golchi gwanedig 250µl (ateb6) ar egwyl o 10s am 4-5 gwaith.Amsugno'r dŵr gweddilliol gyda phapur amsugnol (gellir dileu'r swigen aer gweddill gyda blaen heb ei ddefnyddio).

9.2.8Lliwiad: Ychwanegu hydoddiant swbstrad 50µl A a hydoddiant swbstrad 50ul B at bob ffynnon.Cymysgwch yn ysgafn trwy siglo'r plât â llaw a deorwch am 15 munud ar 25 ℃ gyda gorchudd (gweler 12.8).

9.2.11Mesur: Ychwanegwch 50µl yr hydoddiant stopio i bob ffynnon.Cymysgwch yn ysgafn trwy siglo'r plât â llaw a mesurwch yr amsugnedd ar 450nm (Awgrymodd fesur gyda'r donfedd ddeuol o 450/630nm. Darllenwch y canlyniad o fewn 5 munud ar ôl ychwanegu hydoddiant stop. )

10 Canlyniadau

10.1Canran amsugnedd

Rhennir gwerthoedd cymedrig y gwerthoedd amsugno a gafwyd ar gyfer y safonau a'r samplau â gwerth amsugnedd y safon gyntaf (safon sero) a'i luosi â 100%.Felly gwneir y safon sero yn hafal i 100% a dyfynnir y gwerthoedd amsugno mewn canrannau.

=

B —— safon amsugno (neu sampl)

B0 ——safon amsugno sero

10.2Cromlin Safonol

---- I lunio cromlin safonol: Cymerwch werth amsugnedd safonau fel echel-y, lled logarithmig crynodiad yr hydoddiant safonol AOZ (ppb) fel echelin-x.

---- Mae crynodiad AOZ pob sampl (ppb), y gellir ei ddarllen o'r gromlin graddnodi, yn cael ei luosi â ffactor gwanhau cyfatebol pob sampl a ddilynir, a cheir crynodiad gwirioneddol y sampl.

Sylwch os gwelwch yn dda:

Mae meddalwedd arbennig wedi'i ddatblygu ar gyfer yr holl leihau data, y gellir ei ddarparu ar gais.

Ffactor gwanhau………………………………………..……2

10.Sensitifrwydd, cywirdeb a manwl gywirdeb

Sensitifrwydd: 0.025ppb

Terfyn canfod:

Meinwe (cyhyr, afu)…………………………0.1ppb

Mêl ---------------------------------------------- -0.1ppb

Cywirdeb:

Meinwe anifeiliaid (cyhyr ac afu) ……...…………100 ±20%

Mêl………………………………..………….... 100±20%

trachywiredd:Mae CV pecyn ELISA yn llai na 10%.

11.Hysbysiad

12.1 Bydd gwerthoedd cymedrig y gwerthoedd amsugno a gafwyd ar gyfer y safonau a'r samplau yn cael eu lleihau os nad yw'r adweithyddion a'r samplau wedi'u rheoleiddio i dymheredd ystafell (20-25 ℃).

12.2 Peidiwch â gadael i microwells sychu rhwng camau er mwyn osgoi atgynhyrchu aflwyddiannus a gweithredu'r cam nesaf yn syth ar ôl tapio deiliad y microwells.

12.3 Ysgwydwch bob adweithydd yn ysgafn cyn ei ddefnyddio.

12.4 Cadwch eich croen i ffwrdd o'r toddiant stopio oherwydd ei fod yn 0.5MH₂SO₄ateb.

12.5 Peidiwch â defnyddio'r pecynnau sydd wedi dyddio.Peidiwch â chyfnewid adweithyddion gwahanol sypiau, neu fel arall bydd yn gollwng y sensitifrwydd.

12.6 Cyflwr storio: Cadwch y pecynnau ELISA ar 2-8 ℃, peidiwch â rhewi.Selio platiau microwell gorffwys, Osgoi golau haul syth yn ystod pob deoriad.Argymhellir gorchuddio'r platiau microtiter.

12.7 Dylid rhoi'r gorau i ateb swbstrad os yw'n troi lliwiau.Gall yr adweithyddion ddirywio os yw gwerth amsugnedd (450/630nm) y safon sero yn llai na 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Mae angen yr adwaith coloration 15 munud ar ôl ychwanegu hydoddiant swbstrad;Gallwch ymestyn yr amser deori i 20 munud neu fwy os yw'r lliw yn rhy ysgafn i'w benderfynu., Peidiwch byth â bod yn fwy na 25 munud. I'r gwrthwyneb, cwtogwch yr amser deori yn iawn.

12.9 Y tymheredd adwaith gorau posibl yw 25 ℃.Bydd tymheredd uwch neu is yn arwain at newid gwerthoedd sensitifrwydd ac amsugno.

12.Cyflwr storio a chyfnod storio

Cyflwr storio: 2-8 ℃.

Cyfnod storio: 12 mis.