مصنوعات

1. 1۔پس منظر

Nitrofurans مصنوعی وسیع اسپیکٹرم اینٹی بایوٹک ہیں، جو اکثر جانوروں کی پیداوار میں اس کی بہترین اینٹی بیکٹیریل اور فارماکوکینیٹک خصوصیات کے لیے استعمال کی جاتی ہیں۔انہیں سور، پولٹری اور آبی پیداوار میں ترقی کے فروغ دینے والے کے طور پر بھی استعمال کیا گیا تھا۔لیبارٹری جانوروں کے ساتھ طویل مدتی مطالعہ نے اشارہ کیا کہ والدین کی دوائیں اور ان کے میٹابولائٹس نے سرطان پیدا کرنے والی اور mutagenic خصوصیات کو ظاہر کیا۔اس کی وجہ سے خوراک کی پیداوار کے لیے استعمال ہونے والے جانوروں کے علاج کے لیے نائٹروفوران کی ممانعت ہوئی ہے۔نائٹروفوران ادویات فرلٹاڈون، نائٹروفورانٹون اور نائٹروفورازون کو 1993 میں یورپی یونین میں جانوروں کی خوراک میں استعمال کرنے پر پابندی لگا دی گئی تھی، اور 1995 میں فورازولڈون کا استعمال ممنوع قرار دیا گیا تھا۔

نائٹروفوران دوائیوں کی باقیات کا تجزیہ نائٹروفوران پیرنٹ دوائیوں کے ٹشو باؤنڈ میٹابولائٹس کی کھوج پر مبنی ہونا چاہئے۔چونکہ والدین کی دوائیں بہت تیزی سے میٹابولائز ہوتی ہیں، اور ٹشو کے پابند نائٹروفوران میٹابولائٹس طویل عرصے تک برقرار رہیں گے، اس لیے ان میٹابولائٹس کو نائٹروفوران کے غلط استعمال کا پتہ لگانے میں ہدف کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، جس میں Furazolidone metabolite (AOZ)، Furaltadone metabolite (AMOZ) شامل ہیں۔ )، نائٹروفورانٹائن میٹابولائٹ (AHD) اور نائٹروفورازون میٹابولائٹ (SEM)۔

AOZ- باقیات کا تعین عام طور پر LC-MS یا LC-MS/MS کے ذریعے کیا جاتا ہے۔انزائم امیونوساز، کرومیٹوگرافک طریقوں کے مقابلے میں، حساسیت، پتہ لگانے کی حد، تکنیکی آلات اور وقت کی ضرورت کے حوالے سے کافی فوائد دکھاتے ہیں۔(وقت کی قیمت: 45 منٹ)

1. 2.ٹیسٹ کا اصول

یہ ELISA کٹ بالواسطہ مسابقتی انزائم امیونواسے کے اصول کی بنیاد پر AOZ کا پتہ لگانے کے لیے بنائی گئی ہے۔مائیکرو ٹائٹر کنویں کیپچر BSA سے منسلک اینٹیجن کے ساتھ لیپت ہیں۔AOZ نمونے میں شامل اینٹی باڈی کے لیے مائیکرو ٹائٹر پلیٹ پر لیپت اینٹیجن سے مقابلہ کرتا ہے۔انزائم کنجوگیٹ کے اضافے کے بعد، کروموجینک سبسٹریٹ استعمال کیا جاتا ہے اور سگنل کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا جاتا ہے۔جذب نمونہ میں AOZ ارتکاز کے الٹا متناسب ہے۔

1. 3.ایپلی کیشنز

اس کٹ کو AOZ کی باقیات کے مقداری اور کوالیٹیٹو تجزیہ میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔اینیما ٹشوز(پٹھوں، جگر وغیرہ)، شہد۔

1. 4.کراس رد عمل

Furazolidone میٹابولائٹ (AOZ)………………………..100%

Furaltadone میٹابولائٹ (AMOZ)………………………<0.1%

نائٹروفورنٹائن میٹابولائٹ (AHD)………………………<0.1%

نائٹروفورازون میٹابولائٹ (SEM)………………………………<0.1%

Furazolidone ……………………………………………………… 16.3%

Furaltadone …………………………………………….…<1%

نائٹروفورانٹائن ……………………………………………………… 1%

نائٹروفورازون …………………………………………………<1%

1. 5۔مواد کی ضرورت ہے

5.1سازوسامان

----مائکروٹیٹر پلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (450nm/630nm)

---- روٹری بخارات یا نائٹروجن خشک کرنے والے آلات

---- ہوموجنائزر/سٹومیچر

---- شیکر

----ورٹیکس مکسر

---- سینٹری فیوج

----تجزیاتی توازن (انڈکٹنس: 0.01 گرام)

---- گریجویٹ پائپیٹ: 10 ملی لٹر

---- ربڑ کا پائپیٹ بلب

---- والیومیٹرک فلاسک: 100 ملی لٹر

---- گلاس فلاسک: 10 ملی لٹر

پولی اسٹیرین سینٹرفیوج ٹیوب: 2 ملی لٹر، 50 ملی لٹر

---- مائیکروپیپٹس: 20ul-200ul، 100ul-1000ul،

250ul-ملٹی پیپیٹ

5.2ری ایجنٹس

---- ایتھل ایسیٹیٹ (AR)

-----n-hexane (یا n-heptane) (AR)

---- ڈپوٹاشیم ہائیڈروجن فاسفیٹ ٹرائی ہائیڈریٹ

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- مرتکز ہائیڈروکلورک ایسڈ (HCl, AR)

----- میتھانول

---- سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ (NaOH, AR)

----ڈی آئیونائزڈ پانی

1. 6۔کٹ کے اجزاء

l مائکروٹائٹر پلیٹ اینٹیجن کے ساتھ لیپت، 96 کنویں

معیاری حل (6 بوتلیں، 1 ملی لیٹر/ بوتل)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l اسپائکنگ اسٹینڈرڈ کنٹرول: (1 ملی لیٹر/بوتل).....100ppb

l مرتکز انزائم کنجوگیٹ 1 ملی لٹر ....... سرخ ٹوپی

l انزائم کنجوگیٹ ڈائلائنٹس 10 ملی لیٹر………..گرین ٹوپی

l سبسٹریٹ A 7 ملی لیٹر ……………………………………….. سفید ٹوپی

l سبسٹریٹ B 7 ملی لٹر ……………………………………………… سرخ ٹوپی

l سٹاپ سلوشن 7 ملی لیٹر……………………………… پیلی ٹوپی

l 20×مرتکز واش محلول 40ml

…………………………………… شفاف ٹوپی

l 2 × مرتکز نکالنے کا حل 60 ملی لٹر.... نیلی ٹوپی

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………سفید ٹوپی

1. 7۔ری ایجنٹس کی تیاری

حل 1: مشتق ریجنٹ:

بوتل میں 10 ملی لیٹر میتھانول شامل کریں جس میں 2-نائٹروبینزالڈہائڈ ہے اور تحلیل کریں۔(10 ملی میٹر کی حراستی میں)۔

حل 2: 0.1MK₂HPO₄حل:

وزن 22.8 گرام K₂HPO₄.3H₂O to 1L deionized پانی کو تحلیل کرنے کے لیے۔

حل 3: 1M HCl حل

8.3 ملی لیٹر مرتکز ہائیڈروکلورک ایسڈ کو تحلیل کریں۔ deionized پانی کے ساتھ 100ml.

حل 4:1M NaOH حل

4g NaOH کو 100ml deionized پانی کے ساتھ تحلیل کریں۔

حل 5: نکالنے کا حل

1:1 کے حجم کے تناسب میں ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ 2×مرتکز نکالنے والے محلول کو پتلا کریں۔اس محلول کو 1 ماہ کے لیے 4℃ پر محفوظ کیا جا سکتا ہے، جسے نمونے نکالنے کے لیے استعمال کیا جائے گا۔

حل 6دھونے کا حل:

1:19 کے والیوم راشن میں ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ 20×مرتکز واش محلول کو پتلا کریں، جو پلیٹوں کو دھونے کے لیے استعمال کیا جائے گا۔یہ پتلا محلول 4℃ پر 1 ماہ کے لیے محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

1. 8.نمونے کی تیاری

8.1آپریشن سے پہلے نوٹس اور احتیاطی تدابیر:

a) براہ کرم تجربے میں یک طرفہ ٹپس استعمال کریں، اور مختلف ریجنٹ جذب کرتے وقت ٹپس کو تبدیل کریں۔

ب) اس بات کو یقینی بنائیں کہ تمام تجرباتی آلات صاف ہیں۔

c) مشتق ریجنٹ کو 2-8℃ پر تین ماہ کے لیے محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

d) HCl محلول کو کمرے کے درجہ حرارت پر 3 ماہ تک محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

e) NaOH محلول کو کمرے کے درجہ حرارت پر 3 ماہ تک محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

f) علاج نہ کیے گئے نمونوں کو منجمد میں رکھیں (-20℃)؛

g) علاج شدہ نمونوں کو اندھیرے میں 2-8℃ پر 24 گھنٹے کے لیے محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

8.2 جانوروں کے بافتوں اور جگر کے نمونے:

---- نمونوں کو ہوموجنائزر کے ساتھ ہم آہنگ کریں۔

---- وزن 1.0±0.05 گرام یکساں ٹشو کے نمونے کو 50 ملی لیٹر پولی اسٹیرین سنٹری فیوج ٹیوب میں۔4ml deionized پانی، 0.5ml 1M HCl محلول اور 100ul derivative reagent شامل کریں (حل 1 دیکھیں)۔اسے 2 منٹ تک ہلائیں۔

---- رات بھر 37 ℃ پر انکیوبیٹ کریں (تقریبا 16 گھنٹے)؛

---- 5ml 0.1MK شامل کریں۔₂HPO₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) اور 5ml ethyl acetate۔30s کے لیے زور سے ہلائیں؛

---- کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوج، کم از کم 3000 گرام؛

---- 2.5 ملی لیٹر سپرنٹنٹ آرگینک فیز کو 10 ملی لیٹر صاف شیشے کی ٹیوب میں لیں، 50-60 ℃ نائٹروجن گیس یا روٹری بخارات سے خشک کریں۔

---- بچ جانے والے خشک کو 1ml n-hexane (یا n-heptane) کے ساتھ تحلیل کریں، 30s کے لیے ورٹیکس، 1ml نکالنے کا محلول شامل کریں (حل5)، بنور 1 منٹ، مکمل طور پر مکس کریں۔

---- کمرے کے درجہ حرارت پر سینٹرفیوج (20-25^oج) 5 منٹ کے لیے، کم از کم 3000 گرام؛

---- سپرنٹنٹ نامیاتی مرحلے کو ہٹا دیں؛پرکھ کے لیے سبسٹریٹ واٹر فیز کا 50μl لیں۔

8.4 شہد

---- ایک 50 ملی لیٹر پولی اسٹیرین سنٹری فیوج ٹیوب میں یکساں شہد کے نمونے کا 1.0±0.05 گرام وزن کریں۔

---- 4 ملی لیٹر ڈیونائزڈ پانی شامل کریں، 0.5 ملی لیٹر 1 ایم ایچ سی ایل (حل3) اور 100μl مشتق ریجنٹ (حل1);2 منٹ کے لئے مکمل طور پر ہلائیں؛

---- رات بھر 37 ℃ پر انکیوبیٹ کریں (تقریبا 16 گھنٹے)؛

----5ml 0.1MK شامل کریں۔₂HPO₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) اور 5ml ethyl acetate، 30s کے لیے زور سے ہلائیں۔

----کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر 10 منٹ کے لیے سینٹری فیوج، کم از کم 3000 گرام؛

----سپرناٹینٹ نامیاتی مرحلے کے 2.5 ملی لیٹر کو 10 ملی لیٹر صاف شیشے کی ٹیوب میں لیں، 50-60 ℃ نائٹروجن گیس یا روٹری بخارات کے ساتھ خشک کریں۔

----بچی ہوئی خشک کو 1ml n-hexane (یا n-heptane) کے ساتھ تحلیل کریں، 30s کے لیے ورٹیکس، 1ml نکالنے کا محلول شامل کریں (حل5)، بنور 1 منٹ، مکمل طور پر مکس کریں۔

---- کمرے کے درجہ حرارت پر سینٹری فیوج (20-25^oج) 10 منٹ کے لیے، کم از کم 3000 گرام؛

---- سپرنٹنٹ نامیاتی مرحلے کو ہٹا دیں؛پرکھ کے لیے سبسٹریٹ واٹر فیز کا 50μl لیں۔

1. 9.پرکھ کا عمل

9.1پرکھ سے پہلے نوٹس لیں۔

9.1.1 یقینی بنائیں کہ تمام ریجنٹس اور مائیکرو ویل کمرے کے درجہ حرارت پر ہیں (20-25℃)۔

9.1.2 استعمال کے فوراً بعد باقی تمام ریجنٹس کو 2-8℃ پر واپس کریں۔

9.1.3 مائیکرو ویلز کو صحیح طریقے سے دھونا پرکھ کے عمل میں ایک اہم مرحلہ ہے۔یہ ELISA تجزیہ کی تولیدی صلاحیت کا ایک اہم عنصر ہے۔

9.1.4 روشنی سے بچیں اور انکیوبیشن کے دوران مائیکرو ویلز کو ڈھانپیں۔

9.2 پرکھ کے مراحل

9.2.1 تمام ری ایجنٹس کو کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر 30 منٹ سے زیادہ کے لیے نکالیں، استعمال سے پہلے ہم آہنگ کریں۔

9.2.2 ضروری مائیکرو ویل نکالیں اور باقی کو فوری طور پر 2-8℃ پر زپ لاک بیگ میں واپس کریں۔

9.2.3 مرتکز واش سلوشن اور کنسنٹریٹڈ نکالنے والے محلول کو استعمال سے پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر دوبارہ گرم کیا جانا چاہیے۔

9.2.4نمبر:ہر مائیکرو ویل پوزیشنوں کو نمبر دیا جائے اور تمام معیارات اور نمونے نقل میں چلائے جائیں۔معیارات اور نمونے کی پوزیشنیں ریکارڈ کریں۔

9.2.5مرتکز اینٹی باڈی محلول کی کمزوری۔: مرتکز انزائم محلول کو 1:10 کے حجم کے تناسب میں انزائم کنجوگیٹ ڈائیلوئنٹس کے ساتھ پتلا کریں (1 گنا مرتکز انزائم محلول: 10 فولڈ انزائم کنجوگیٹ ڈائلوئنٹس)۔

9.2.6معیاری حل / نمونہ اور انزائم کنجوگیٹ حل شامل کریں۔: 50µl معیاری محلول یا تیار کردہ نمونہ متعلقہ کنوؤں میں شامل کریں، 50µl انزائم کنجوگیٹ محلول شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے ہلکے سے مکس کریں اور 25℃ پر 30 منٹ تک کور کے ساتھ سینکیں۔

9.2.7دھونا: ڈھکن کو آہستہ سے ہٹائیں اور کنوؤں سے مائع نکالیں اور مائیکرو ویلز کو 250µl پتلے ہوئے واش محلول سے دھوئیں (حل6) 10 سیکنڈ کے وقفے سے 4-5 بار۔جاذب کاغذ کے ساتھ بقایا پانی کو جذب کریں (باقی ہوا کے بلبلے کو غیر استعمال شدہ نوک سے ختم کیا جا سکتا ہے)۔

9.2.8رنگ کاری: ہر کنویں میں 50µl سبسٹریٹ محلول A اور 50µl سبسٹریٹ محلول B شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے آہستہ سے مکس کریں اور کور کے ساتھ 25℃ پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کریں (12.8 دیکھیں)۔

9.2.11پیمائش کریں۔: ہر کنویں میں 50µl سٹاپ محلول شامل کریں۔پلیٹ کو دستی طور پر ہلاتے ہوئے آہستہ سے مکس کریں اور 450nm پر جاذبیت کی پیمائش کریں (اس نے 450/630nm کی دوہری طول موج کے ساتھ پیمائش کی تجویز کی ہے۔ سٹاپ سلوشن شامل کرنے کے بعد 5 منٹ کے اندر نتیجہ پڑھیں۔)

10 نتائج

10.1فی صد جذب

معیارات اور نمونوں کے لیے حاصل کردہ جاذب قدروں کی اوسط قدروں کو پہلے معیار (صفر معیاری) کی جاذب قدر سے تقسیم کیا جاتا ہے اور 100% سے ضرب کیا جاتا ہے۔اس طرح صفر کے معیار کو 100% کے برابر بنایا جاتا ہے اور جاذبیت کی قدریں فیصد میں بتائی جاتی ہیں۔

=

بی ——جذب کا معیار (یا نمونہ)

B0 —— جذب صفر معیار

10.2معیاری وکر

----ایک معیاری منحنی خطوط کھینچنے کے لیے: معیارات کی جاذبیت کی قدر کو y-axis کے طور پر لیں، AOZ معیاری محلول (ppb) کے ارتکاز کا نیم لوگارتھمک بطور x-محور۔

----ہر نمونے (ppb) کی AOZ ارتکاز، جسے کیلیبریشن کریو سے پڑھا جا سکتا ہے، اس کے بعد آنے والے ہر نمونے کے متعلقہ dilution عنصر سے ضرب کیا جاتا ہے، اور نمونے کی اصل ارتکاز حاصل کی جاتی ہے۔

برائے مہربانی نوٹ کریں:

تمام ڈیٹا میں کمی کے لیے خصوصی سافٹ ویئر تیار کیا گیا ہے، جو درخواست پر فراہم کیا جا سکتا ہے۔

کم کرنے کا عنصر………………………………………………….

10۔حساسیت، درستگی اور درستگی

حساسیت: 0.025ppb

پتہ لگانے کی حد:

ٹشو (عضلات، جگر) ………………………… 0.1ppb

شہد ------------------------------------------------- -0.1ppb

درستگی:

جانوروں کے ٹشو (پٹھے اور جگر) ………………………100±20%

شہد ………………………………………………… 100±20%

درستگی:ELISA کٹ کا CV 10% سے کم ہے۔

11۔نوٹس

12.1 معیارات اور نمونوں کے لیے حاصل کردہ جاذبیت کی اوسط قدریں کم ہو جائیں گی اگر ری ایجنٹس اور نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت (20-25℃) پر ریگولیٹ نہیں کیا گیا ہے۔

12.2 ناکام تولیدی صلاحیت سے بچنے کے لیے مائیکرو ویلز کو مراحل کے درمیان خشک نہ ہونے دیں اور مائیکرو ویلز ہولڈر کو تھپتھپانے کے فوراً بعد اگلا مرحلہ چلائیں۔

12.3 استعمال کرنے سے پہلے ہر ریجنٹ کو آہستہ سے ہلائیں۔

12.4 اپنی جلد کو اسٹاپ سلوشن سے دور رکھیں کیونکہ یہ 0.5MH ہے۔₂SO₄حل

12.5 پرانی کٹس کا استعمال نہ کریں۔مختلف بیچوں کے ری ایجنٹس کا تبادلہ نہ کریں، ورنہ اس سے حساسیت ختم ہو جائے گی۔

12.6 اسٹوریج کی حالت: ELISA کٹس کو 2-8℃ پر رکھیں، منجمد نہ کریں۔باقی مائیکرو ویل پلیٹوں کو سیل کریں، تمام انکیوبیشن کے دوران سیدھی سورج کی روشنی سے بچیں۔مائکرو ٹائٹر پلیٹوں کو ڈھانپنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

12.7 سبسٹریٹ محلول کو ترک کر دینا چاہیے اگر یہ رنگ بدل جائے۔ری ایجنٹس خراب ہو سکتے ہیں اگر صفر معیار کی جاذب قدر (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) سے کم ہو۔

12.8 سبسٹریٹ محلول کے اضافے کے بعد رنگین رد عمل کو 15 منٹ کی ضرورت ہوتی ہے۔آپ انکیوبیشن کے وقت کو 20 منٹ یا اس سے زیادہ تک بڑھا سکتے ہیں اگر رنگ کا تعین کرنے کے لیے بہت ہلکا ہو۔، کبھی بھی 25 منٹ سے زیادہ نہ ہو۔

12.9 بہترین رد عمل کا درجہ حرارت 25 ℃ ہے۔زیادہ یا کم درجہ حرارت حساسیت اور جاذبیت کی قدروں میں تبدیلی کا باعث بنے گا۔

12.اسٹوریج کی حالت اور اسٹوریج کی مدت

سٹوریج کی حالت: 2-8℃

ذخیرہ کرنے کی مدت: 12 ماہ.