محصول

1. 1.پس منظر

نایټروفوران مصنوعي پراخه سپیکٹرم انټي بیوټیکونه دي، چې په مکرر ډول د حیواناتو په تولید کې د دې غوره انټي باکتریا او فارماکوکینټیک ملکیتونو لپاره کارول کیږي.دوی د خنزیر، چرګانو او د اوبو په تولید کې د ودې د ودې په توګه هم کارول شوي.د لابراتوار څارویو سره په اوږد مهاله مطالعاتو کې ښودل شوي چې اصلي درمل او د دوی میټابولیتونه د کارسنجینیک او میټاګینیک ځانګړتیاوې ښودلې.دا د خوړو د تولید لپاره کارول شوي څارویو درملنې لپاره د نایټروفوران منع کیدو لامل شوی.د نایټروفوران درمل furaltadone، nitrofurantoin او nitrofurazone په 1993 کې په EU کې د خوړو د څارویو په تولید کې د کارولو منع شوي وو، او د furazolidone کارول په 1995 کې منع شوي وو.

د نايټروفوران درملو د پاتې شونو تحليل ته اړتيا ده چې د نايټروفوران د اصلي درملو د نسج تړل شوي ميټابوليټونو د کشف پر بنسټ وي.څرنګه چې اصلي درمل خورا ګړندي میټابولیز کیږي ، او د نسج سره تړلي نایټروفوران میټابولیټ به د اوږدې مودې لپاره ساتي ، نو دا میټابولیتونه د نایټروفوران د ناوړه ګټې اخیستنې په کشف کې د هدف په توګه کارول کیږي ، چې پکې د Furazolidone میټابولیټ (AOZ) ، Furaltadone میټابولیټ (AMOZ) شامل دي. )، Nitrofurantoin metabolite (AHD) او Nitrofurazone metabolite (SEM).

د AOZ پاتې شونه په عموم ډول د LC-MS یا LC-MS/MS لخوا ټاکل کیږي.د کروماتوګرافیک میتودونو په پرتله د انزایمونو معافیتونه د حساسیت ، کشف حد ، تخنیکي تجهیزاتو او وخت اړتیا په اړه د پام وړ ګټې ښیې.(د وخت لګښت: 45 دقیقې)

1. 2.د ازموینې اصول

دا د ELISA کټ د غیر مستقیم رقابتي انزایم اموناساسي اصولو پراساس د AOZ کشف کولو لپاره ډیزاین شوی.د مایکروټیټر څاګانې د نیول شوي BSA پورې تړلي انټيجن سره پوښل شوي.AOZ په نمونه کې د انټي باډي اضافه کولو لپاره د مایکروټیټر پلیټ کې لیپت شوي انټيجن سره سیالي کوي.د انزایم کنجوګیټ اضافه کولو وروسته ، کروموجینک سبسټریټ کارول کیږي او سیګنال د سپیکٹرو فوټومیټر لخوا اندازه کیږي.جذب په نمونه کې د AOZ غلظت سره متناسب دی.

1. 3.غوښتنلیکونه

دا کټ د AOZ پاتې شونو کمي او کیفیتي تحلیل کې کارول کیدی شيانیما نسجونه(عضلات، ځيګر او نور)، شات.

1. 4.متقابل غبرګونونه

Furazolidone metabolite (AOZ)………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)………………………<0.1%

نايټروفورانتين ميتابوليټ (AHD)………………………<0.1%

نايټروفورازون ميتابوليټ (SEM)………………………………<0.1%

Furazolidone …………………………………………… 16.3%

Furaltadone ……………………………………………………<1%

نايټروفورانتوين ……………………………………………… 1%

نايټروفورازون ……………………………………………… 1٪

1. 5.اړین توکي

5.1تجهیزات

---- مایکروټیټر پلیټ سپیکٹرو فوټومیټر (450nm/630nm)

---- روټري بخارات یا د نایتروجن وچولو وسیلې

---- همغږي کونکی / معدې جوړونکی

----- شاکر

---- وورتیکس مکسر

---- سینټرفیوج

---- تحلیلي توازن (انډکشن: 0.01g)

---- فارغ شوی پایپټ: 10ml

---- د ربړ پایپټ بلب

---- حجمي فلاسک: 100ml

---- د شیشې فلاسک: 10 ملی لیتر

----پولیسټرین سینټرفیوج ټیوب: 2ml، 50ml

---- مایکروپیپیټس: 20ul-200ul، 100ul-1000ul،

250ul-multipipette

5.2Reagents

---- ایتیل اسټیټ (AR)

-----n-hexane (یا n-heptane) (AR)

---- ډیپوتاشیم هایدروجن فاسفیټ ټری هایدریټ

(K₂HPO₄.3H₂او) (AR)

---- متمرکز هایډروکلوریک اسید (HCl, AR)

----- میتانول

---- سوډیم هایدروکسایډ (NaOH, AR)

---- ډیونیز شوي اوبه

1. 6.د کټ اجزا

l د مایکروټیټر پلیټ د انټيجن سره پوښل شوی، 96 څاګانې

l معیاري حلونه (6 بوتلونه، 1 ملی لیتر / بوتل)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l سپیکینګ معیاري کنټرول: (1 ملی لیتر / بوتل) …….100ppb

l متمرکز انزایم کنجوګیټ 1 ملی لیتر ....... سور کیپ

l انزایم کنجوګیټ ډیلوینټس 10 ملی لیتر ………..شنه کیپ

l سبسټریټ A 7 ملی لیتر ……………………………………………….. سپینه خولۍ

l سبسټریټ B 7 ملی لیتر………………………………………….. سور کیپ

l ودروي محلول 7ml……………………………… ژیړ کیپ

l 20 × متمرکز د مینځلو محلول 40ml

…………………………………… شفاف خولۍ

l 2×متمرکز استخراج محلول 60ml .... نیلي کیپ

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… سپینه خولۍ

1. 7.Reagents چمتو کول

د حل لاره 1: مشتق reagent:

په بوتل کې 10 ملی لیتر میتانول اضافه کړئ چې 2-Nitrobenzaldehyde لري او حل کړئ.(د 10mM غلظت کې).

د حل لاره 2: 0.1MK₂HPO₄حل

وزن 22.8 ګرامه K₂HPO₄.3H₂د منحل کولو لپاره له 1 لیتره ډیونیز شوي اوبه.

د حل لاره 3: 1M HCl حل

د 8.3ml متمرکز هایدروکلوریک اسید تحلیل کړئ د deionized اوبو سره 100ml.

4 حل:1M NaOH حل

4g NaOH د 100ml deionized اوبو سره حل کړئ.

د حل 5د استخراج حل

2 × متمرکز استخراج محلول د 1: 1 حجم په تناسب کې د ډیونیز شوي اوبو سره کم کړئ.دا محلول د 1 میاشتې لپاره په 4℃ کې ساتل کیدی شي، کوم چې به د نمونو استخراج لپاره وکارول شي.

د حل لاره 6د مینځلو حل:

د 1:19 حجم راشن کې د 20 × متمرکز واش محلول د ډیونیز شوي اوبو سره ضعیف کړئ ، کوم چې د پلیټونو مینځلو لپاره کارول کیږي.دا حل شوی محلول د 1 میاشتې لپاره په 4 ℃ کې ساتل کیدی شي.

1. ۸.د نمونې تیاری

۸.۱د عملیاتو دمخه خبرتیا او احتیاط:

a) مهرباني وکړئ په تجربه کې یو اړخیز لارښوونې وکاروئ، او لارښوونې بدل کړئ کله چې مختلف ریجنټ جذب کړئ.

b) ډاډ ترلاسه کړئ چې ټول تجربه لرونکي وسایل پاک دي.

c) مشتق ریجنټ د دریو میاشتو لپاره په 2-8 ℃ کې ساتل کیدی شي؛

d) د HCl محلول د 3 میاشتو لپاره د خونې په حرارت کې ساتل کیدی شي؛

e) د NaOH محلول د خونې په حرارت کې د 3 میاشتو لپاره ساتل کیدی شي؛

f) د درملنې نه شوي نمونې په یخچال کې وساتئ (-20℃)؛

g) درملنه شوي نمونې د 24 ساعتونو لپاره په 2-8 ℃ کې په تیاره کې ساتل کیدی شي.

8.2 د څارويو نسج او ځيګر نمونې:

---- نمونې د هوموجنیزر سره همغږي کړئ؛

---- وزن 1.0±0.05g د همجنسي نسج نمونې په 50ml پولی سټیرین سینټرفیوج ټیوب کې.4ml deionized اوبه، 0.5ml 1M HCl محلول او 100ul derivative reagent اضافه کړئ (حل 1 وګورئ).د 2 دقیقو لپاره یې وخورئ.

---- د شپې په 37 ℃ کې انکیوب کړئ (شاوخوا 16h)؛

---- 5ml 0.1MK اضافه کړئ₂HPO₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) او 5ml ethyl acetate.د 30s لپاره په کلکه وخورئ؛

---- د خونې د حرارت درجه (20-25 ℃) کې د 10 دقیقو لپاره سینټرفیوج، لږترلږه 3000 ګرامه؛

---- د سپرناټینټ عضوي مرحله 2.5ml په 10ml پاک شیشې ټیوب کې واخلئ، د 50-60 ℃ نایتروجن ګاز یا روټري بخارۍ سره وچ کړئ؛

---- وچه پاتې برخه د 1ml n-hexane (یا n-heptane) سره حل کړئ، د 30s لپاره ورټیکس، 1ml استخراج محلول اضافه کړئ (حل5)، vortex 1min، په بشپړه توګه مخلوط کړئ.

---- سینټرفیوج د خونې د حرارت درجه (20-25^oج) د 5 دقیقو لپاره، لږترلږه 3000 ګرامه؛

---- د سپرناټینټ عضوي مرحله لرې کړئ؛د ارزونې لپاره د سبسټریټ اوبو مرحله 50μl واخلئ.

8.4 شات

---- 1.0 ± 0.05 ګرامه وزن لرونکی شاتو نمونه په 50 ملی لیتر پولی سټیرین سینټرفیوج ټیوب کې؛

---- 4 ملی لیتر ډیونیز شوي اوبه اضافه کړئ، 0.5 ملی لیتر 1M HCl (حل3) او 100μl مشتق ریجنټ (حل۱);د 2 دقیقو لپاره په بشپړه توګه وخورئ؛

---- د شپې په 37 ℃ کې انکیوب کړئ (شاوخوا 16h)؛

---- 5ml 0.1MK اضافه کړئ₂HPO₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) او 5ml ethyl acetate، د 30s لپاره په شدت سره وخورئ؛

---- سینټرفیوج د خونې په حرارت (20-25 ℃) کې د 10 دقیقو لپاره، لږترلږه 3000 ګرامه؛

---- د سپرناټینټ عضوي مرحله 2.5ml په 10ml پاک شیشې ټیوب کې واخلئ، د 50-60 ℃ نایتروجن ګاز یا روټري بخارۍ سره وچ کړئ؛

---- وچه پاتې برخه د 1ml n-hexane (یا n-heptane) سره منحل کړئ، د 30s لپاره vortex، 1ml استخراج محلول اضافه کړئ (حل5)، vortex 1min، په بشپړه توګه مخلوط کړئ.

---- سینټرفیوج د خونې په حرارت کې (20-25^oج) د 10 دقیقو لپاره، لږترلږه 3000 ګرامه؛

---- د سپرناټینټ عضوي مرحله لرې کړئ؛د ارزونې لپاره د سبسټریټ اوبو مرحله 50μl واخلئ.

1. ۹.د ارزونې پروسه

9.1د ارزونې دمخه خبرتیا

9.1.1 ډاډ ترلاسه کړئ چې ټول ریجنټ او مایکرو ویل ټول د خونې په حرارت درجه کې دي (20-25℃).

9.1.2 د کارونې وروسته سمدلاسه ټول پاتې ریجنټونه 2-8 ℃ ته بیرته ورکړئ.

9.1.3 د مایکرو ویلونو مینځل په سمه توګه د ارزونې په پروسه کې یو مهم ګام دی.دا د ELISA تحلیل د بیا تولید لپاره حیاتي فاکتور دی.

9.1.4 د ر lightا څخه ډډه وکړئ او د انکیوبیشن پرمهال مایکرو ویلونه پوښئ.

9.2 د ارزونې مرحلې

9.2.1 د خونې په حرارت (20-25 ℃) کې د 30 دقیقو څخه ډیر لپاره ټول ریجنټونه وباسئ، مخکې له دې چې استعمال شي یو شان کړئ.

9.2.2 د اړتیا وړ مایکرو ویلونه ترلاسه کړئ او پاتې نور سمدلاسه په 2-8 ℃ کې د زپ لاک کڅوړې ته راستانه کړئ.

9.2.3 د مینځلو متمرکز محلول او د استخراج متمرکز محلول باید د کارونې دمخه د خونې په حرارت کې وي.

9.2.4شمېره:د هر مایکرویل پوستونو شمیرل شوي او ټول معیارونه او نمونې باید په نقل سره پرمخ وړل شي.د معیارونو او نمونو پوستونه ثبت کړئ.

9.2.5د متمرکز انټي باډي محلول کمول: متمرکز انزایم محلول د انزایم کنجوجیټ ډیلوینټس سره د 1:10 حجم په تناسب کې ضعیف کړئ (1 فولډ متمرکز انزایم محلول: 10 فولډ انزایم کنجوګټ ډیلوینټس).

9.2.6معیاري محلول / نمونه او انزایم کنجوګیټ حل اضافه کړئ: 50µl معیاري محلول یا چمتو شوې نمونه په اړونده څاګانو کې اضافه کړئ، 50µl انزایم کنجوګټ محلول اضافه کړئ.په لاسي ډول د پلیټ په وهلو سره په نرمۍ سره مخلوط کړئ او د 30 دقیقو لپاره په 25 ℃ کې د پوښ سره سینګار کړئ.

9.2.7وینځل: پوښ په نرمۍ سره لرې کړئ او د څاګانو څخه مایع وباسئ او مایکرو ویلونه د 250µl د مینځلو شوي مینځلو محلول سره مینځل کړئ (حل6) د 10s په وقفه کې د 4-5 ځله لپاره.پاتې اوبه د جاذب کاغذ سره جذب کړئ (باقي هوا بلبل د غیر استعمال شوي ټیپ سره له مینځه وړل کیدی شي).

9.2.8رنګ ورکول: هر څاه ته 50µl سبسټریټ محلول A او 50µl سبسټریټ محلول B اضافه کړئ.په لاسي ډول د پلیټ په ډبولو سره په نرمۍ سره مخلوط کړئ او د 15 دقیقو لپاره په 25 ℃ کې د پوښ سره سینګار کړئ (12.8 وګورئ).

9.2.11اندازه کول: هر څاه ته 50µl د سټاپ محلول اضافه کړئ.په لاسي ډول د پلیټ ډبرې کولو سره په نرمۍ سره مخلوط کړئ او جذب په 450nm اندازه کړئ (دا د 450/630nm دوه ګوني طول موج سره اندازه کولو وړاندیز شوی. د سټاپ محلول اضافه کولو وروسته په 5 دقیقو کې پایله ولولئ.)

10 پایلې

10.1د سلنې جذب

د معیارونو او نمونو لپاره ترلاسه شوي د جذب ارزښتونو اوسط ارزښتونه د لومړي معیار (صفر معیار) د جذب ارزښت لخوا ویشل شوي او د 100٪ لخوا ضرب کیږي.د صفر معیار په دې توګه د 100٪ سره برابر شوی او د جذب ارزښتونه په فیصدو کې حواله شوي.

=

B ——جذب معیار (یا نمونه)

B0 —— جذب صفر معیار

10.2معیاري وکر

---- د معیاري منحني د رسم کولو لپاره: د معیارونو جاذب ارزښت د y-axis په توګه واخلئ، د AOZ معیاري محلول (ppb) د غلظت نیمه لوګاریتمیک د x-axis په توګه.

---- د هرې نمونې د AOZ غلظت (ppb)، چې د کیلیبریشن منحني څخه لوستل کیدی شي، د تعقیب شوي هرې نمونې د ورته کمولو فکتور سره ضرب کیږي، او د نمونې اصلي غلظت ترلاسه کیږي.

مهرباني وکړئ پام وکړئ:

د ټولو ډیټا کمولو لپاره ځانګړي سافټویر رامینځته شوی ، کوم چې په غوښتنه چمتو کیدی شي.

د کمولو فکتور………………………………………………

10.حساسیت، دقت او دقت

حساسیت: 0.025ppb

د کشف حد:

نسج (عضلات، ځيګر) ……………………… 0.1ppb

شات -------------------------------------------------- -0.1ppb

دقت:

د څارويو نسج (عضلات او ځيګر) …………………… 100±20%

شات ……………………………………………… 100±20%

دقیقیت:د ELISA کټ CV له 10٪ څخه کم دی.

11.خبرتیا

12.1 د معیارونو او نمونو لپاره ترلاسه شوي د جذب ارزښتونو اوسط ارزښتونه به راټیټ شي که چیرې ریجنټونه او نمونې د خونې د تودوخې (20-25 ℃) سره تنظیم شوي نه وي.

12.2 مایکرو ویلونو ته اجازه مه ورکوئ چې د ګامونو په مینځ کې وچ شي ترڅو د بیا تولید ناکامه کیدو مخه ونیسي او د مایکرو ویل هولډر له نل کولو وروسته سمدلاسه بل ګام پرمخ بوځي.

12.3 د کارولو دمخه هر یو ریجنټ په نرمۍ سره وویشئ.

12.4 خپل پوټکی د سټاپ محلول څخه لرې وساتئ ځکه چې دا 0.5MH دی₂SO₄حل

12.5 زاړه کټونه مه کاروئ.د مختلفو بستونو ریجنټونه مه تبادله کوئ، که نه نو دا به حساسیت راټیټ کړي.

12.6 د ذخیره کولو حالت: د ELISA کټونه په 2-8 ℃ کې وساتئ، کنګل مه کوئ.د آرام مایکرویل پلیټونه مهر کړئ ، د ټولو انکیوبیشن پرمهال د مستقیم لمر وړانګو څخه مخنیوی وکړئ.د مایکروټیټر پلیټونو پوښل سپارښتنه کیږي.

12.7 د سبسټریټ محلول باید پریښودل شي که چیرې دا رنګ بدل کړي.ریجنټونه ممکن خراب شي که چیرې د صفر معیار د جذب ارزښت (450/630nm) له 0.5 (A450nm<0.5) څخه کم وي.

12.8 د سبسټریټ محلول اضافه کولو وروسته د رنګ کولو عکس العمل 15 دقیقو ته اړتیا لري؛تاسو کولی شئ د انکیوبیشن وخت تر 20 دقیقو یا ډیر اوږد کړئ که چیرې رنګ خورا روښانه وي د ټاکل کیدو لپاره. هیڅکله له 25 دقیقو څخه ډیر مه کوئ. برعکس ، د انکیوبیشن وخت په سمه توګه لنډ کړئ.

12.9 د عکس العمل غوره تودوخه 25 ℃ ده.لوړه یا ټیټه تودوخه به د حساسیت او جذب ارزښتونو بدلون لامل شي.

12.د ذخیره کولو حالت او د ذخیره کولو موده

د ذخیره کولو حالت: 2-8℃

د ذخیره کولو موده: 12 میاشتې.