Kit d'immunoassaig enzimàtic competitiu per a l'anàlisi quantitativa del metabòlit de furazolidona (AOZ)
- 1.Fons
Els nitrofurans són antibiòtics sintètics d'ampli espectre, que s'utilitzen freqüentment en la producció animal per les seves excel·lents propietats antibacterianes i farmacocinètiques.També s'havien utilitzat com a promotors del creixement en la producció porcina, avícola i aquàtica.En estudis a llarg termini amb animals de laboratori van indicar que els fàrmacs progenitors i els seus metabòlits mostraven característiques cancerígenes i mutagèniques.Això ha portat a la prohibició dels nitrofurans per al tractament d'animals utilitzats per a la producció d'aliments.L'any 1993 es va prohibir l'ús de la furaltadona, la nitrofurantoïna i la nitrofurazona en la producció d'animals alimentaris a la UE i l'any 1995 es va prohibir l'ús de furazolidona.
L'anàlisi dels residus de fàrmacs de nitrofuran s'ha de basar en la detecció dels metabòlits units als teixits dels fàrmacs de nitrofuran.Com que els fàrmacs originals es metabolitzen molt ràpidament i els metabòlits de nitrofuran units als teixits es conservaran durant molt de temps, aquests metabòlits s'utilitzen com a objectiu en la detecció de l'abús de nitrofurans, que inclouen el metabòlit de furazolidona (AOZ), el metabòlit de furaltadona (AMOZ). ), metabòlit de nitrofurantoïna (AHD) i metabòlit de nitrofurazona (SEM).
Els residus d'AOZ es determinen més habitualment per LC-MS o LC-MS/MS.Els immunoassaigs enzimàtics, en comparació amb els mètodes cromatogràfics, mostren avantatges considerables pel que fa a la sensibilitat, el límit de detecció, l'equip tècnic i el requeriment de temps.(Cost del temps: 45 minuts)
- 2.Principi de prova
Aquest kit ELISA està dissenyat per detectar AOZ basat en el principi d'immunoassaig enzimàtic competitiu indirecte.Els pous de microtitulació estan recoberts amb antigen de captura lligat a BSA.AOZ a la mostra competeix amb l'antigen recobert a la placa de microtitulació per a l'anticòs afegit.Després de l'addició de conjugat enzimàtic, s'utilitza un substrat cromogènic i el senyal es mesura amb un espectrofotòmetre.L'absorció és inversament proporcional a la concentració d'AOZ a la mostra.
- 3.Aplicacions
Aquest kit es pot utilitzar en l'anàlisi quantitativa i qualitativa de residus d'AOZteixits d'ànima(múscul, fetge, etc.), mel.
- 4.Reaccions creuades
Metabòlit de furazolidona (AOZ)…………..100%
Metabòlit de furaltadona (AMOZ)…………………………<0,1%
Metabòlit de nitrofurantoïna (AHD)…………………………<0,1%
Metabòlit de nitrofurazona (SEM)………...…<0,1%
Furazolidona…………………………………………….…..…16,3%
Furaltadona…………………………………………………….…<1%
Nitrofurantoïna…………………………………………………….…….…<1%
Nitrofurazona……………………………………………………..…<1%
- 5.Materials necessaris
5.1Equipaments
---- Espectrofotòmetre de placa de microtitulació (450nm/630nm)
----Evaporador rotatiu o instruments d'assecat de nitrogen
----Homogeneïtzador/estómac
----Agitador
---- Mesclador Vortex
----Centrífuga
---- Balanç analític (inductància: 0,01 g)
----Pipeta graduada: 10ml
---- Bombeta de pipeta de goma
----Flascó aforat: 100ml
----Flascó de vidre: 10ml
----Tub centrífuga de poliestirè: 2ml, 50ml
----Micropipetes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multippette
5.2Reactius
----Acetat d'etil (AR)
----n-hexà (o n-heptà) (AR)
----Hidrogen fosfat dipotassi trihidrat
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Àcid clorhídric concentrat (HCl, AR)
-----Metanol
---- Hidròxid de sodi (NaOH, AR)
----Aigua desionitzada
- 6.Components del kit
l Placa de microtitulació recoberta d'antigen, 96 pous
l Solucions estàndard (6 ampolles, 1 ml/ampolla)
0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Control estàndard de punxada: (1 ml/ampolla).......100 ppb
l Conjugat enzimàtic concentrat 1ml……..tap vermell
l Diluents enzimàtics conjugats 10 ml………..tap verd
l Substrat A 7ml………..............…....…..…..tap blanc
l Substrat B 7ml………..............…........….…..tap vermell
l Solució de parada 7 ml…………………………… tap groc
l 20×solució de rentat concentrada 40ml
……………………………………………………….……tapa transparent
l 2×solució d'extracció concentrada 60ml….tap blau
l 2-Nitrobenzaldehid 15,1mg……cap blanc
- 7.Preparació de reactius
Solució 1: reactiu derivat:
Afegiu 10 ml de metanol a l'ampolla amb 2-Nitrobenzaldehid i dissoleu.(a la concentració de 10 mM).
Solució 2: 0,1 MK2HPO4solució:
Pes 22,8 g K2HPO4.3H2O a 1L d'aigua desionitzada per dissoldre.
Solució 3: solució de HCl 1M
Dissoleu 8,3 ml d'àcid clorhídric concentrat amb aigua desionitzada fins a 100 ml.
Solució 4:Solució 1M de NaOH
Dissoleu 4 g de NaOH amb 100 ml d'aigua desionitzada.
Solució 5: solució d'extracció:
Diluïu 2 x la solució d'extracció concentrada amb aigua desionitzada en una proporció de volum d'1:1.Aquesta solució es pot conservar durant 1 mes a 4 ℃, que s'utilitzarà per extreure mostres.
Solució 6: solució de rentat:
Dilueix la solució de rentat concentrada 20 × amb aigua desionitzada en la ració de volum d'1:19, que s'utilitzarà per rentar les plaques.Aquesta solució diluïda es pot conservar durant 1 mes a 4 ℃.
- 8.Preparacions de mostres
8.1Avís i precaucions abans de l'operació:
a) Si us plau, utilitzeu puntes úniques a l'experiment i canvieu les puntes quan absorbiu diferents reactius.
b) Assegureu-vos que tots els instruments experimentals estiguin nets.
c) el reactiu derivat es pot conservar a 2-8 ℃ durant tres mesos;
d) La solució de HCl es pot conservar a temperatura ambient durant 3 mesos;
e) La solució de NaOH es pot conservar 3 mesos a temperatura ambient;
f) Mantenir les mostres no tractades congelades (-20 ℃);
g) Les mostres tractades es poden conservar durant 24 h a 2-8 ℃ a la foscor.
8.2 Mostres de teixit animal i fetge:
----Homogeneïtzar les mostres amb homogeneïtzador;
---- Pes 1,0 ± 0,05 g de la mostra de teixit homogeneïtzada en un tub de centrífuga de poliestirè de 50 ml.Afegiu 4 ml d'aigua desionitzada, 0,5 ml de solució d'HCl 1M i 100 ul de reactiu derivat (vegeu la solució 1).Agiteu-ho durant 2 minuts.
---- Incubar a 37 ℃ durant la nit (unes 16 h);
---- Afegiu 5 ml 0,1 MK2HPO4 (solució2), 0,4 ml de NaOH 1M (solució4) i 5 ml d'acetat d'etil.Agiteu amb força durant 30 segons;
---- Centrifugar a temperatura ambient (20-25 ℃) durant 10 minuts, almenys 3000 g;
---- Agafeu 2,5 ml de la fase orgànica sobrenedant en un tub de vidre net de 10 ml, assequeu-lo amb nitrogen de 50-60 ℃ o un evaporador rotatiu;
---- Dissoleu les restes seques amb 1 ml de n-hexà (o n-heptà), agitar durant 30 segons, afegiu 1 ml de solució d'extracció (solució5), vortex 1 min, barreja completament.
---- Centrifugar a temperatura ambient (20-25oC) durant 5 minuts, almenys 3000 g;
---- Eliminar la fase orgànica sobrenedant;Preneu 50 μl de la fase aquosa del substrat per a l'assaig.
8.4 Mel
---- peseu 1,0 ± 0,05 g de la mostra de mel homogeneïtzada en un tub de centrífuga de poliestirè de 50 ml;
----Afegiu 4 ml d'aigua desionitzada, 0,5 ml d'HCl 1M (solució3) i 100μl de reactiu derivat (solució1);agitar completament durant 2 minuts;
----Incubar a 37 ℃ durant la nit (unes 16 h);
----Afegiu 5 ml 0,1 MK2HPO4 (solució2), 0,4 ml de NaOH 1M (solució4) i 5 ml d'acetat d'etil, agiteu amb força durant 30 segons;
----Centrífuga a temperatura ambient (20-25 ℃) durant 10 minuts, almenys 3000 g;
---- Agafeu 2,5 ml de la fase orgànica sobrenedant en un tub de vidre net de 10 ml, assequeu-lo amb un gas nitrogenat de 50-60 ℃ o un evaporador rotatiu;
---- Dissoleu les restes seques amb 1 ml de n-hexà (o n-heptà), agitar durant 30 segons, afegiu 1 ml de solució d'extracció (solució5), vortex 1 min, barreja completament.
----Centrifugar a temperatura ambient (20-25oC) durant 10 minuts, almenys 3000 g;
----Elimineu la fase orgànica sobrenedant;Preneu 50 μl de la fase aquosa del substrat per a l'assaig.
- 9.Procés d'assaig
9.1Avís abans de l'assaig
9.1.1 Assegureu-vos que tots els reactius i micropous estiguin a temperatura ambient (20-25 ℃).
9.1.2 Torneu tots els reactius restants a 2-8 ℃ immediatament després de l'ús.
9.1.3 Rentar correctament els micropous és un pas important en el procés d'assaig;és el factor vital per a la reproductibilitat de l'anàlisi ELISA.
9.1.4 Eviteu la llum i cobreixi els micropouets durant la incubació.
9.2 Passos de l'assaig
9.2.1 Traieu tots els reactius a temperatura ambient (20-25 ℃) durant més de 30 minuts, homogeneïtzeu-los abans d'utilitzar-los.
9.2.2 Traieu els micropous necessaris i torneu la resta a la bossa amb cremallera a 2-8 ℃ immediatament.
9.2.3 La solució de rentat concentrada i la solució d'extracció concentrada s'han de tornar a escalfar perquè estiguin a temperatura ambient abans d'utilitzar-les.
9.2.4Número:Les posicions numerades de cada micropout i tots els estàndards i mostres s'han d'executar per duplicat.Anoteu els estàndards i les posicions de les mostres.
9.2.5Dilució de la solució concentrada d'anticossos: dilueix la solució enzimàtica concentrada amb diluents conjugats enzimàtics en una proporció de volum d'1:10 (solució enzimàtica concentrada 1 vegades: diluents conjugats enzimàtics de 10 vegades).
9.2.6Afegiu una solució estàndard/mostra i una solució de conjugat enzimàtic: afegir 50 µl de solució estàndard o mostra preparada als pous corresponents, afegir 50 µl de solució de conjugat enzimàtic.Barrejar suaument agitant la placa manualment i incubar durant 30 minuts a 25 ℃ amb tapa.
9.2.7Rentar: Traieu suaument la tapa i aboqueu el líquid dels pous i esbandiu els micropous amb 250 µl de solució de rentat diluïda (solució6) a intervals de 10 segons durant 4-5 vegades.Absorbiu l'aigua residual amb paper absorbent (la bombolla d'aire restant es pot eliminar amb la punta no utilitzada).
9.2.8Coloració: Afegiu 50 µl de solució de substrat A i 50 µl de solució de substrat B a cada pou.Barrejar suaument movent la placa manualment i incubar durant 15 minuts a 25 ℃ amb tapa (vegeu 12.8).
9.2.11Mesura: Afegiu 50 µl de solució de parada a cada pou.Barregeu suaument movent la placa manualment i mesureu l'absorbància a 450 nm (va suggerir mesurar amb la longitud d'ona dual de 450/630 nm. Llegiu el resultat en 5 minuts després de l'addició de la solució de parada. )
10 Resultats
10.1Percentatge d'absorbància
Els valors mitjans dels valors d'absorbància obtinguts per als estàndards i les mostres es divideixen pel valor d'absorbància del primer estàndard (estàndard zero) i es multipliquen pel 100%.Així, l'estàndard zero es fa igual al 100% i els valors d'absorbància es comenten en percentatges.
=
B ——estàndard d'absorbància (o mostra)
B0 ——absorbància zero estàndard
10.2Corba estàndard
----Per dibuixar una corba estàndard: pren el valor d'absorbància dels estàndards com a eix y, semi-logarítmica de la concentració de la solució estàndard AOZ (ppb) com a eix x.
----La concentració AOZ de cada mostra (ppb), que es pot llegir a partir de la corba de calibratge, es multiplica pel factor de dilució corresponent de cada mostra seguida i s'obté la concentració real de la mostra.
Si us plau, tingueu en compte:
S'ha desenvolupat un programari especial per a tota la reducció de dades, que es pot proporcionar a petició.
Factor de dilució…………………………………………………2
10.Sensibilitat, precisió i precisió
Sensibilitat: 0,025 ppb
Límit de detecció:
Teixit (múscul, fetge)………………………… 0,1 ppb
Mel ------------------------------------------------- -0,1 ppb
Precisió:
Teixit animal (múscul i fetge)…………………100±20%
Mel………………………………………..………….. 100±20%
Precisió:El CV del kit ELISA és inferior al 10%.
11.Avís
12.1 Els valors mitjans dels valors d'absorbància obtinguts per als estàndards i les mostres es reduiran si els reactius i les mostres no s'han regulat a temperatura ambient (20-25 ℃).
12.2 No deixeu que els micropous s'assequin entre els passos per evitar una reproductibilitat infructuosa i feu servir el següent pas immediatament després de tocar el suport de micropous.
12.3 Agiteu cada reactiu suaument abans del seu ús.
12.4 Mantingueu la pell lluny de la solució de parada perquè és el 0,5MH2SO4solució.
12.5 No utilitzeu els kits obsolets.No intercanvieu els reactius de lots diferents, o en cas contrari reduirà la sensibilitat.
12.6 Condicions d'emmagatzematge: mantingueu els kits ELISA a 2-8 ℃, no congeleu.Segellar les plaques de micropous en repòs, evitar la llum solar directa durant totes les incubacions.Es recomana cobrir les plaques de microtitulació.
12.7 La solució de substrat s'ha d'abandonar si canvia de color.Els reactius es poden deteriorar si el valor d'absorbància (450/630 nm) de l'estàndard zero és inferior a 0,5 (A450nm <0,5).
12.8 La reacció de coloració necessita 15 minuts després de l'addició de la solució de substrat;Podeu allargar el temps d'incubació fins a 20 minuts o més si el color és massa clar per determinar-lo, mai no supereu els 25 minuts. Al contrari, reduïu el temps d'incubació correctament.
12.9 La temperatura de reacció òptima és de 25 ℃.Una temperatura més alta o més baixa comportarà canvis en els valors de sensibilitat i absorbància.
12.Condicions d'emmagatzematge i període d'emmagatzematge
Condicions d'emmagatzematge: 2-8 ℃.
Període d'emmagatzematge: 12 mesos.
