mahsulot

1. 1.Fon

Nitrofuranlar sintetik keng spektrli antibiotiklar bo'lib, ular ajoyib antibakterial va farmakokinetik xususiyatlari uchun hayvonlar ishlab chiqarishda tez-tez qo'llaniladi.Ular, shuningdek, cho'chqa, parrandachilik va suv ishlab chiqarishda o'sish stimulyatorlari sifatida ishlatilgan.Laboratoriya hayvonlari bilan uzoq muddatli tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, asosiy dorilar va ularning metabolitlari kanserogen va mutagen xususiyatlarga ega.Bu oziq-ovqat ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan hayvonlarni davolash uchun nitrofuranlarni taqiqlashga olib keldi.Nitrofuran preparatlari furaltadon, nitrofurantoin va nitrofurazon 1993 yilda Evropa Ittifoqida hayvonlarning oziq-ovqat ishlab chiqarishida foydalanish taqiqlangan va 1995 yilda furazolidondan foydalanish taqiqlangan.

Nitrofuran preparatlari qoldiqlarini tahlil qilish asosiy nitrofuran dorilarining to'qimalar bilan bog'langan metabolitlarini aniqlashga asoslangan bo'lishi kerak.Asosiy dorilar juda tez metabolizmga uchraganligi va to'qimalar bilan bog'langan nitrofuran metabolitlari uzoq vaqt davomida saqlanib qolishi sababli, bu metabolitlar Furazolidon metaboliti (AOZ), Furaltadon metaboliti (AMOZ) ni o'z ichiga olgan nitrofuranlarni suiiste'mol qilishni aniqlashda maqsad sifatida ishlatiladi. ), Nitrofurantoin metaboliti (AHD) va Nitrofurazon metaboliti (SEM).

AOZ qoldiqlari ko'pincha LC-MS yoki LC-MS/MS tomonidan aniqlanadi.Ferment immunoassaylari xromatografik usullar bilan solishtirganda sezgirlik, aniqlash chegarasi, texnik jihozlar va vaqt talablari bo'yicha katta afzalliklarga ega.(Vaqt narxi: 45 daqiqa)

1. 2.Sinov printsipi

Ushbu ELISA to'plami bilvosita raqobatbardosh ferment immunoassay tamoyiliga asoslangan AOZni aniqlash uchun mo'ljallangan.Mikrotitr quduqlari BSA ga bog'langan antigen bilan qoplangan.Namunadagi AOZ qo'shilgan antikor uchun mikrotitr plastinkasida qoplangan antigen bilan raqobatlashadi.Ferment konjugati qo'shilgandan so'ng, xromogen substrat ishlatiladi va signal spektrofotometr bilan o'lchanadi.Absorbtsiya namunadagi AOZ konsentratsiyasiga teskari proportsionaldir.

1. 3.Ilovalar

Ushbu to'plamdan AOZ qoldiqlarini miqdoriy va sifat jihatidan tahlil qilishda foydalanish mumkinjonli to'qimalar(mushak, jigar va boshqalar), asal.

1. 4.O'zaro reaktsiyalar

Furazolidon metaboliti (AOZ)……………………..100%

Furaltadon metaboliti (AMOZ)……………………<0,1%

Nitrofurantoin metaboliti (AHD) ……………………<0,1%

Nitrofurazon metaboliti (SEM)………………………<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…16,3%

Furaltadon………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon…………………………………………..…<1%

1. 5.Kerakli materiallar

5.1Uskunalar

---- Mikrotitr plastinka spektrofotometri (450nm/630nm)

---- Aylanadigan bug'lantiruvchi yoki azotli quritish asboblari

---- Gomogenizator / oshqozon

---- Shaker

----Vortex mikser

---- Santrifuga

---- Analitik muvozanat (induktivlik: 0,01 g)

---- Pipetka: 10ml

---- Rezina pipetkali lampochka

----Hajmli kolba: 100ml

---- Shisha kolba: 10 ml

----Polistirol santrifüj trubkasi: 2ml, 50ml

----Mikropipetlar: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipet

5.2Reaktivlar

---- Etil asetat (AR)

----n-geksan (yoki n-geptan) (AR)

---- Dikaliy vodorod fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Konsentrlangan xlorid kislotasi (HCl, AR)

-----Metanol

---- Natriy gidroksid (NaOH, AR)

---- Deionlashtirilgan suv

1. 6.Kit komponentlari

l Antigen bilan qoplangan mikrotitr plitasi, 96 ta quduq

l Standart eritmalar (6 shisha, 1 ml / shisha)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Spiking standart nazorati: (1ml/shisha)........100ppb

l Konsentrlangan ferment konjugati 1ml........qizil qopqoq

l Enzim konjugati erituvchilari 10ml………..yashil qopqoq

l Substrat A 7ml………………………..…..oq qopqoq

l Substrat B 7ml………………………….…..qizil qopqoq

l to'xtatish eritmasi 7ml ...........................................

l 20 × konsentrlangan yuvish eritmasi 40 ml

…………………………………….…………………………shaffof qalpoq

l 2× konsentrlangan ekstraksiya eritmasi 60ml….ko‘k qopqoq

l 2-Nitrobenzaldegid 15,1 mg………………oq qopqoq

1. 7.Reaktivlarni tayyorlash

Yechim 1: hosila reaktivi:

2-Nitrobenzaldegidli shishaga 10 ml metanol qo'shing va eritib yuboring.(10 mM konsentratsiyada).

Yechim 2: 0,1 MK₂HPO₄yechim:

Og'irligi 22,8 g K₂HPO₄.3H₂Eritish uchun O dan 1 litrgacha deionlangan suv.

Yechim 3: 1M HCl eritmasi

8,3 ml konsentrlangan xlorid kislotani eritib yuboring deionlangan suv bilan 100 ml gacha.

Yechim 4:1M NaOH eritmasi

4 g NaOH ni 100 ml deionlangan suv bilan eritib yuboring.

Yechim 5: ekstraktsiya eritmasi:

2× konsentrlangan ekstraksiya eritmasini deionlangan suv bilan 1:1 hajm nisbatida suyultiring.Ushbu eritma 1 oy davomida 4 ℃ da saqlanishi mumkin, u olingan namunalar uchun ishlatiladi.

Yechim 6: yuvish eritmasi:

20 × konsentrlangan yuvish eritmasini 1:19 hajmdagi deionlangan suv bilan suyultiring, bu esa plitalarni yuvish uchun ishlatiladi.Ushbu suyultirilgan eritma 4 ° C da 1 oy davomida saqlanishi mumkin.

1. 8.Tayyorlash namunalari

8.1Operatsiyadan oldin ogohlantirish va ehtiyot choralari:

a) Iltimos, tajribada bir martalik maslahatlardan foydalaning va turli reagentlarni singdirishda maslahatlarni o'zgartiring.

b) Barcha eksperimental asboblar toza ekanligiga ishonch hosil qiling.

c) hosilaviy reagent 2-8 ℃ haroratda uch oy davomida saqlanishi mumkin;

d) HCl eritmasi xona haroratida 3 oy davomida saqlanishi mumkin;

e) NaOH eritmasi xona haroratida 3 oy saqlanishi mumkin;

f) ishlov berilmagan namunalarni muzlatkichda saqlang (-20 ℃);

g) Qayta ishlangan namunalar 2-8 ℃ haroratda 24 soat qorong'ilikda saqlanishi mumkin.

8.2 Hayvon to'qimalari va jigar namunalari:

---- Namunalarni gomogenizator bilan homogenlash;

---- Og'irligi 1,0±0,05 g gomogenlangan to'qima namunasini 50 ml polistirolli santrifüj naychasiga soling.4ml deionizatsiyalangan suv, 0,5ml 1M HCl eritmasi va 100ul hosilaviy reagent qo'shing (1-eritmaga qarang).2 daqiqa davomida silkiting.

---- Bir kechada 37 ℃ da inkubatsiya qiling (taxminan 16 soat);

---- 5ml 0,1MK qo'shing₂HPO₄ (yechim2), 0,4ml 1M NaOH (yechim4) va 5 ml etil asetat.30 soniya davomida qattiq silkiting;

---- Xona haroratida (20-25 ℃) 10 daqiqa, kamida 3000 g santrifüj qiling;

---- 2,5 ml supernatant organik fazasini 10 ml toza shisha naychaga oling, 50-60 ℃ azot gazi yoki aylanadigan evaporatator bilan quriting;

---- Quruq qoldiqni 1 ml n-geksan (yoki n-geptan) bilan eritib, 30 s davomida aylantiring, 1 ml ekstraksiya eritmasini qo'shing (yechim5), 1 daqiqa vorteks qiling, to'liq aralashtiring.

---- Xona haroratida santrifüj qiling (20-25^oC) 5 minut, kamida 3000 g;

---- Supernatant organik fazani olib tashlang;tahlil qilish uchun substrat suv fazasidan 50 mkl oling.

8.4 Asal

---- 1,0 ± 0,05 g gomogenlashtirilgan asal namunasini 50 ml polistirolli sentrifuga naychasiga torting;

---- 4 ml deionlangan suv, 0,5 ml 1 M HCl qo'shing (yechim3) va 100 mkl hosila reaktivi (yechim1);2 daqiqa davomida butunlay silkiting;

---- Bir kechada 37 ℃ da inkubatsiya qiling (taxminan 16 soat);

---- 5ml 0,1MK qo'shing₂HPO₄ (yechim2), 0,4ml 1M NaOH (yechim4) va 5 ml etil asetat, 30 soniya davomida qattiq silkiting;

---- Xona haroratida (20-25 ℃) 10 daqiqa, kamida 3000 g santrifüj qiling;

---- 2,5 ml supernatant organik fazasini 10 ml toza shisha naychaga oling, 50-60 ℃ azot gazi yoki aylanadigan evaporatator bilan quriting;

---- Quruq qoldiqni 1 ml n-geksan (yoki n- geptan) bilan eritib, 30 soniya davomida aylantiring, 1 ml ekstraksiya eritmasi qo'shing (yechim5), 1 daqiqa vorteks qiling, to'liq aralashtiring.

---- Xona haroratida santrifüj qiling (20-25^oC) 10 minut, kamida 3000 g;

---- Supernatant organik fazani olib tashlang;tahlil qilish uchun substrat suv fazasidan 50 mkl oling.

1. 9.Tahlil jarayoni

9.1Tahlil qilishdan oldin e'tibor bering

9.1.1 Barcha reagentlar va mikro quduqlar xona haroratida (20-25 ℃) ekanligiga ishonch hosil qiling.

9.1.2 Qolgan barcha reagentlarni ishlatishdan keyin darhol 2-8 ℃ ga qaytaring.

9.1.3 Mikro quduqlarni to'g'ri yuvish tahlil jarayonida muhim qadamdir;bu Elishay tahlilining takrorlanishining muhim omilidir.

9.1.4 Inkubatsiya vaqtida yorug'likdan qoching va mikro quduqlarni yoping.

9.2 Tahlil bosqichlari

9.2.1 Barcha reagentlarni xona haroratida (20-25 ℃) 30 daqiqadan ko'proq vaqt davomida olib tashlang, ishlatishdan oldin bir hil holga keltiring.

9.2.2 Zarur bo'lgan mikro quduqlarni chiqarib oling va qolganlarini zudlik bilan 2-8 ℃ haroratda qulflangan qopga qaytaring.

9.2.3 Konsentrlangan yuvish eritmasi va konsentrlangan ekstraksiya eritmasi ishlatishdan oldin xona haroratida bo'lishi uchun qayta isitilishi kerak.

9.2.4Raqam:Har bir mikroquduq pozitsiyalari raqamlangan va barcha standartlar va namunalar ikki nusxada bajarilishi kerak.Standartlar va namunalar pozitsiyalarini yozib oling.

9.2.5Konsentrlangan antikor eritmasini suyultirish: konsentrlangan ferment eritmasini ferment konjugati erituvchilari bilan 1:10 hajm nisbatida suyultiring (1 marta konsentrlangan ferment eritmasi: 10 marta ferment konjugati erituvchilari).

9.2.6Standart eritma / namuna va ferment konjugati eritmasini qo'shing: 50 µl standart eritma yoki tayyorlangan namunani mos keladigan quduqlarga qo‘shing, 50 µl ferment konjugati eritmasini qo‘shing.Plastinani qo'lda silkitib, sekin aralashtiramiz va qopqoq bilan 25 ° C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.

9.2.7Yuvish: Qopqoqni muloyimlik bilan echib oling va suyuqlikni quduqlardan to'kib tashlang va mikro quduqlarni 250 µl suyultirilgan yuvish eritmasi bilan yuving (yechim6) 10s oraliqda 4-5 marta.Qolgan suvni changni yutish qog'oz bilan so'rang (qolgan havo pufakchasini ishlatilmagan uchi bilan yo'q qilish mumkin).

9.2.8Rang berish: Har bir quduqqa 50 µl substrat eritmasi A va 50 ul substrat eritmasi B qo‘shing.Plastinani qo'lda silkitib, sekin aralashtiramiz va qopqoq bilan 25 ℃ da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling (12.8 ga qarang).

9.2.11O'lchov: Har bir quduqqa 50 µl to‘xtatuvchi eritma qo‘shing.Plastinani qo'lda silkitib, sekin aralashtiramiz va absorbansni 450 nm da o'lchang (U 450/630 nm ikki to'lqin uzunligi bilan o'lchashni tavsiya qiladi. To'xtash eritmasi qo'shilgandan keyin 5 daqiqa ichida natijani o'qing. )

10 Natijalar

10.1Foizli absorbsiya

Standartlar va namunalar uchun olingan absorbans qiymatlarining o'rtacha qiymatlari birinchi standartning absorbans qiymatiga (nol standart) bo'linadi va 100% ga ko'paytiriladi.Shunday qilib, nol standarti 100% ga teng bo'ladi va absorbans qiymatlari foizlarda ko'rsatilgan.

=

B —— absorbsiya standarti (yoki namunasi)

B0 ——yutilish nol standarti

10.2Standart egri chiziq

----Standart egri chizish uchun: etalonlarning absorbans qiymatini y o'qi sifatida, AOZ standart eritmasi konsentratsiyasining yarim logarifmikini (ppb) x o'qi sifatida oling.

----Kalibrlash egri chizig'idan o'qilishi mumkin bo'lgan har bir namunaning AOZ kontsentratsiyasi (ppb) kuzatilgan har bir namunaning mos keladigan suyultirish koeffitsientiga ko'paytiriladi va namunaning haqiqiy konsentratsiyasi olinadi.

E'tibor bering:

Barcha ma'lumotlarni qisqartirish uchun maxsus dasturiy ta'minot ishlab chiqilgan bo'lib, ular so'rov bo'yicha taqdim etilishi mumkin.

Suyultirish omili…………………………………………………2

10.Sezuvchanlik, aniqlik va aniqlik

Sezuvchanlik: 0,025ppb

Aniqlash chegarasi:

To'qimalar (mushaklar, jigar)…………………………0,1ppb

Asal------------------------------------------------- -0,1ppb

Aniqlik:

Hayvon to'qimalari (mushak va jigar) …………………100±20%

Asal…………………………………………………….. 100±20%

Aniqlik:ELISA to'plamining CV 10% dan kam.

11.Eslatma

12.1 Agar reagentlar va namunalar xona haroratiga (20-25 ℃) sozlanmagan bo'lsa, standartlar va namunalar uchun olingan absorbans qiymatlarining o'rtacha qiymatlari kamayadi.

12.2 Muvaffaqiyatsiz takrorlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun qadamlar orasida mikro quduqlarning quritilishiga yo'l qo'ymang va mikro quduq ushlagichiga tegib bo'lgandan so'ng darhol keyingi bosqichni bajaring.

12.3 Ishlatishdan oldin har bir reagentni muloyimlik bilan silkiting.

12.4 Teringizni to'xtatuvchi eritmadan uzoqroq tuting, chunki u 0,5 MH₂SO₄yechim.

12.5 Eskirgan to'plamlardan foydalanmang.Turli partiyalarning reagentlarini almashtirmang, aks holda bu sezgirlikni pasaytiradi.

12.6 Saqlash holati: ELISA to'plamlarini 2-8 ℃ haroratda saqlang, muzlatib qo'ymang.Mikro quduq plitalarini muhrlab qo'ying, barcha inkubatsiyalar davomida to'g'ridan-to'g'ri quyosh nurlaridan saqlaning.Mikrotitr plitalarini yopish tavsiya etiladi.

12.7 Agar u rangga aylansa, substrat eritmasidan voz kechish kerak.Nol standartining absorbsiya qiymati (450/630nm) 0,5 dan (A450nm<0,5) kam bo'lsa, reagentlar yomonlashishi mumkin.

12.8 Rang berish reaktsiyasi uchun substrat eritmasi qo'shilgandan keyin 15 minut kerak bo'ladi;Rangni aniqlash uchun juda ochiq bo'lsa, siz inkubatsiya vaqtini 20 minut yoki undan ko'proq uzaytirishingiz mumkin. Hech qachon 25 daqiqadan oshmasligi kerak. Aksincha, inkubatsiya vaqtini to'g'ri qisqartiring.

12.9 Optimal reaksiya harorati 25 ℃.Yuqori yoki past harorat sezgirlik va absorbans qiymatlarining o'zgarishiga olib keladi.

12.Saqlash holati va saqlash muddati

Saqlash holati: 2-8 ℃.

Saqlash muddati: 12 oy.