Kilpaileva entsyymi-immunomäärityssarja furatsolidonimetaboliitin (AOZ) kvantitatiiviseen analyysiin
Kilpailukykyinen entsyymi-immunomäärityssarja
Kvantitatiivinen analyysiFuratsolidonin metaboliitti(AOZ)
- 1.Tausta
Nitrofuraanit ovat synteettisiä laajakirjoisia antibiootteja, joita käytetään usein eläintuotannossa erinomaisten antibakteeristen ja farmakokineettisten ominaisuuksiensa vuoksi.Niitä oli myös käytetty kasvunedistäjinä sian-, siipikarjan- ja vesiviljelyssä.Pitkäaikaiset laboratorio-eläintutkimukset osoittivat, että emolääkkeillä ja niiden metaboliitteilla oli syöpää aiheuttavia ja mutageenisia ominaisuuksia.Tämä on johtanut nitrofuraanien kieltämiseen elintarviketuotantoon käytettävien eläinten hoidossa.Nitrofuraanilääkkeiden furaltadonin, nitrofurantoiinin ja nitrofuratsonin käyttö elintarvikeeläintuotannossa kiellettiin EU:ssa vuonna 1993, ja furatsolidonin käyttö kiellettiin vuonna 1995.
Nitrofuraanilääkejäämien analyysin on perustuttava nitrofuraanin emolääkkeiden kudokseen sitoutuneiden metaboliittien havaitsemiseen.Koska emolääkkeet metaboloituvat erittäin nopeasti ja kudokseen sitoutuneet nitrofuraanimetaboliitit säilyvät pitkään, näitä metaboliitteja käytetään kohteena nitrofuraanien väärinkäytön havaitsemisessa, mukaan lukien furatsolidonimetaboliitit (AOZ), furaltadonimetaboliitit (AMOZ) ), nitrofurantoiinimetaboliitti (AHD) ja nitrofuratsonin metaboliitti (SEM).
AOZ-tähteet määritetään yleisimmin LC-MS:llä tai LC-MS/MS:llä.Entsyymi-immunomääritykset kromatografisiin menetelmiin verrattuna osoittavat huomattavia etuja herkkyyden, havaitsemisrajan, teknisten laitteiden ja aikavaatimuksen suhteen.(Ajan hinta: 45 min)
- 2.Testin periaate
Tämä ELISA-sarja on suunniteltu havaitsemaan AOZ epäsuoran kilpailevan entsyymi-immunomäärityksen periaatteen perusteella.Mikrotiitterikuopat päällystetään sieppaus-BSA-sidoksella antigeenillä.Näytteen AOZ kilpailee mikrotiitterilevylle päällystetyn antigeenin kanssa lisätystä vasta-aineesta.Entsyymikonjugaatin lisäämisen jälkeen käytetään kromogeenistä substraattia ja signaali mitataan spektrofotometrillä.Absorptio on kääntäen verrannollinen näytteen AOZ-pitoisuuteen.
- 3.Sovellukset
Tätä sarjaa voidaan käyttää AOZ-jäämän kvantitatiivisessa ja laadullisessa analyysissäanima-kudoksia(lihas, maksa jne.), hunaja.
- 4.Ristireaktiot
Furatsolidonin metaboliitti (AOZ)………………………..100 %
Furaltadonin metaboliitti (AMOZ)……………………<0,1 %
Nitrofurantoiinin metaboliitti (AHD)………………………<0,1 %
Nitrofuratsonin metaboliitti (SEM)…………………………<0,1 %
Furatsolidoni……………………………………………..…16,3 %
Furaltadone………………………………………………..<1 %
Nitrofurantoiini……………………………………….…….…<1 %
Nitrofuratsoni………………………………………………<1 %
- 5.Tarvittavat materiaalit
5.1Varusteet
----Mikrotiitterilevyspektrofotometri (450nm/630nm)
---- Pyörivä haihdutin tai typen kuivausvälineet
----Homogenisaattori /vatsastaja
---- Shaker
----Vortex-sekoitin
----Sentrifugi
----Analyyttinen vaaka (induktanssi: 0,01g)
----Astepipetti: 10 ml
----Kumipipetin polttimo
---- Mittapullo: 100 ml
---- Lasipullo: 10 ml
----Polystyreenisentrifugiputki: 2ml, 50ml
----Mikropipetit: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multipipetti
5.2Reagenssit
----etyyliasetaatti (AR)
----n-heksaani (tai n-heptaani) (AR)
----Dikaliumvetyfosfaattitrihydraatti
(K2HPO4.3H2O) (AR)
---- Väkevä suolahappo (HCl, AR)
----- Metanoli
---- Natriumhydroksidi (NaOH, AR)
---- Deionisoitu vesi
- 6.Sarjan komponentit
l Antigeenillä päällystetty mikrotiitterilevy, 96 kuoppaa
l Vakioliuokset (6 pulloa, 1 ml/pullo)
0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Piikitysvakiosäätö: (1ml/pullo)....100 ppb
l Tiivistetty entsyymikonjugaatti 1ml.........punainen korkki
l Entsyymikonjugaattilaimentimet 10ml………..vihreä korkki
l Substraatti A 7 ml……………………………..valkoinen korkki
l Substraatti B 7 ml………………………………..punainen korkki
l Pysäytysliuosta 7 ml……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l 20× väkevä pesuliuos 40ml
…………………………………….……läpinäkyvä korkki
l 2×tiivistetty uuttoliuos 60ml….sininen korkki
l 2-nitrobentsaldehydi 15,1 mg…………………valkoinen korkki
- 7.Reagenssien valmistus
Ratkaisu 1: johdannaisreagenssi:
Lisää 10 ml metanolia 2-nitrobentsaldehydiä sisältävään pulloon ja liuota.(konsentraatiolla 10 mM).
Ratkaisu 2: 0,1 MK2HPO4ratkaisu:
Paino 22,8 g K2HPO4.3H20 - 1 l deionisoitua vettä liukenemaan.
Ratkaisu 3: 1 M HCl-liuos
Liuota 8,3 ml väkevää suolahappoa deionisoidulla vedellä 100 ml:ksi.
Ratkaisu 4:1 M NaOH-liuos
Liuota 4 g NaOH:a 100 ml:aan deionisoitua vettä.
Ratkaisu 5: uuttoliuos:
Laimenna 2x väkevä uuttoliuos deionisoidulla vedellä tilavuussuhteessa 1:1.Tätä liuosta voidaan säilyttää 1 kuukausi 4 ℃:ssa, jota käytetään näytteiden uuttamiseen.
Ratkaisu 6: pesuliuos:
Laimenna 20-kertainen väkevä pesuliuos deionisoidulla vedellä tilavuussuhteessa 1:19, jota käytetään levyjen pesuun.Tätä laimennettua liuosta voidaan säilyttää 1 kuukauden ajan 4 ℃:ssa.
- 8.Näytevalmisteet
8.1Huomautus ja varotoimet ennen käyttöä:
a) Käytä kokeessa kertakäyttöisiä kärkiä ja vaihda kärkiä, kun imet eri reagenssia.
b) Varmista, että kaikki koelaitteet ovat puhtaita.
c) johdannaisreagenssia voidaan säilyttää 2-8 ℃:ssa kolme kuukautta;
d) HCl-liuosta voidaan säilyttää huoneenlämpötilassa 3 kuukautta;
e) NaOH-liuosta voidaan säilyttää 3 kuukautta huoneenlämpötilassa;
f) Säilytä käsittelemättömät näytteet pakkasessa (-20 ℃);
g) Käsiteltyjä näytteitä voidaan säilyttää 24 tuntia 2-8 ℃:ssa pimeässä.
8.2 Eläinkudos- ja maksanäytteet:
----Homogenoi näytteet homogenisaattorilla;
---- Punnitaan 1,0±0,05 g homogenisoitua kudosnäytettä 50 ml:n polystyreenisentrifugiputkeen.Lisää 4 ml deionisoitua vettä, 0,5 ml 1 M HCl-liuosta ja 100 ul johdannaisreagenssia (katso liuos 1).Ravista 2 minuuttia.
---- Inkuboi 37 ℃:ssa yön yli (noin 16 tuntia);
---- Lisää 5ml 0,1MK2HPO4 (ratkaisu2), 0,4 ml 1 M NaOH (ratkaisu4) ja 5 ml etyyliasetaattia.Ravista voimakkaasti 30 sekunnin ajan;
---- Sentrifugoi huoneenlämmössä (20-25 ℃) 10 minuuttia, vähintään 3000 g;
---- Ota 2,5 ml supernatanttia orgaanista faasia 10 ml:n puhtaaseen lasiputkeen, kuivaa 50-60 ℃ typpikaasulla tai pyöröhaihduttimella;
---- Liuota kuiva jäännös 1 ml:aan n-heksaania (tai n-heptaania), vorteksoi 30 sekuntia, lisää 1 ml uuttoliuosta (ratkaisu5), vorteksoi 1 min, sekoita kokonaan.
---- Sentrifugoi huoneenlämmössä (20-25oC) 5 minuutin ajan, vähintään 3000 g;
---- Poista supernatantti orgaaninen faasi;ota 50 μl substraattivesifaasia määritystä varten.
8.4 Kulta
----punnitaan 1,0±0,05 g homogenisoitua hunajanäytettä 50 ml:n polystyreenisentrifugiputkeen;
----Lisää 4 ml deionisoitua vettä, 0,5 ml 1 M HCl:a (ratkaisu3) ja 100 μl johdannaisreagenssia (ratkaisu1);ravista täysin 2 minuuttia;
----Inkuboi 37 ℃:ssa yön yli (noin 16 tuntia);
----Lisää 5ml 0,1MK2HPO4 (ratkaisu2), 0,4 ml 1 M NaOH (ratkaisu4) ja 5 ml etyyliasetaattia, ravista voimakkaasti 30 sekunnin ajan;
----Sentrifugoi huoneenlämmössä (20-25 ℃) 10 minuuttia, vähintään 3000 g;
----Ota 2,5 ml supernatanttia orgaanista faasia 10 ml:n puhtaaseen lasiputkeen, kuivaa 50-60 ℃ typpikaasulla tai pyöröhaihduttimella;
----Liuota kuiva jäännös 1 ml:aan n-heksaania (tai n-heptaania), vorteksoi 30 sekuntia, lisää 1 ml uuttoliuosta (ratkaisu5), vorteksoi 1 min, sekoita kokonaan.
----Sentrifugoi huoneenlämmössä (20-25oC) 10 minuutin ajan, vähintään 3000 g;
----Poista supernatantti orgaaninen faasi;ota 50 μl substraattivesifaasia määritystä varten.
- 9.Määritysprosessi
9.1Huomaa ennen määritystä
9.1.1 Varmista, että kaikki reagenssit ja mikrokuopat ovat kaikki huoneenlämpöisiä (20-25 ℃).
9.1.2 Palauta kaikki loput reagenssit 2-8 ℃:seen välittömästi käytön jälkeen.
9.1.3 Mikrokuoppien oikea pesu on tärkeä vaihe määritysprosessissa.se on elintärkeä tekijä ELISA-analyysin uusittavuuden kannalta.
9.1.4 Vältä valoa ja peitä mikrokuopat inkuboinnin aikana.
9.2 Määritysvaiheet
9.2.1 Ota kaikki reagenssit pois huoneenlämmössä (20-25 ℃) yli 30 minuutin ajaksi, homogenisoi ennen käyttöä.
9.2.2 Ota tarvittavat mikrokuopat ulos ja palauta loput välittömästi vetoketjulliseen pussiin 2-8℃ lämpötilaan.
9.2.3 Konsentroitu pesuliuos ja tiivistetty uuttoliuos tulee lämmittää uudelleen huoneenlämpöisiksi ennen käyttöä.
9.2.4Määrä:Numeroitu jokainen mikrokuoppapaikka ja kaikki standardit ja näytteet tulee ajaa kahtena kappaleena.Kirjaa muistiin standardit ja näytepaikat.
9.2.5Väkevän vasta-aineliuoksen laimennus: laimenna konsentroitu entsyymiliuos entsyymikonjugaattilaimentimilla tilavuussuhteessa 1:10 (1-kertainen konsentroitu entsyymiliuos: 10-kertainen entsyymikonjugaattilaimennusaine).
9.2.6Lisää standardiliuos/näyte ja entsyymikonjugaattiliuos: lisää 50 µl standardiliuosta tai valmistettua näytettä vastaaviin kuoppiin, lisää 50 µl entsyymikonjugaattiliuosta.Sekoita varovasti ravistamalla levyä käsin ja inkuboi 30 minuuttia 25 ℃:ssa kannen kanssa.
9.2.7Pestä: Poista kansi varovasti ja kaada neste pois kuopista ja huuhtele mikrokuopat 250 µl:lla laimennettua pesuliuosta (ratkaisu6) 10 sekunnin välein 4-5 kertaa.Imeytä jäännösvesi imukykyisellä paperilla (jäljellä oleva ilmakupla voidaan poistaa käyttämättömällä kärjellä).
9.2.8Väri: Lisää 50 µl substraattiliuosta A ja 50 µl substraattiliuosta B kuhunkin kuoppaan.Sekoita varovasti keinuttamalla levyä käsin ja inkuboi 15 minuuttia 25 ℃:ssa kannen kanssa (katso 12.8).
9.2.11Mitata: Lisää 50 µl pysäytysliuosta jokaiseen kuoppaan.Sekoita varovasti keinuttamalla levyä manuaalisesti ja mittaa absorbanssi aallonpituudella 450 nm (se ehdotti mittaamista kaksoisaallonpituudella 450/630 nm. Lue tulos 5 minuutin sisällä pysäytysliuoksen lisäämisen jälkeen.)
10 Tulokset
10.1Absorptioprosentti
Standardeille ja näytteille saatujen absorbanssiarvojen keskiarvot jaetaan ensimmäisen standardin absorbanssiarvolla (nollastandardi) ja kerrotaan 100 %:lla.Nollastandardiksi tehdään näin ollen 100 % ja absorbanssiarvot ilmoitetaan prosentteina.
=
B - absorbanssistandardi (tai näyte)
B0 ——absorbanssin nollastandardi
10.2Vakiokäyrä
----Vakiokäyrän piirtäminen: Otetaan standardien absorbanssiarvo y-akseliksi, puolilogaritminen AOZ-standardiliuoksen pitoisuudesta (ppb) x-akseliksi.
----Jokaisen näytteen AOZ-pitoisuus (ppb), joka voidaan lukea kalibrointikäyrästä, kerrotaan kunkin seurattavan näytteen vastaavalla laimennuskertoimella ja saadaan näytteen todellinen pitoisuus.
Huomaa:
Kaikkeen tietojen vähentämiseen on kehitetty erityinen ohjelmisto, joka voidaan toimittaa pyynnöstä.
Laimennuskerroin……………………………………………………… 2
10.Herkkyys, tarkkuus ja tarkkuus
Herkkyys: 0,025 ppb
Tunnistusraja:
Kudos (lihas, maksa)………………………… 0,1 ppb
Hunaja------------------------------------------------- -0,1 ppb
Tarkkuus:
Eläinkudos (lihas ja maksa)…………………100±20 %
Hunaja………………………………………………….. 100±20%
Tarkkuus:ELISA-sarjan CV on alle 10 %.
11.Ilmoitus
12.1 Standardeille ja näytteille saatujen absorbanssiarvojen keskiarvot pienenevät, jos reagensseja ja näytteitä ei ole säädetty huoneenlämpötilaan (20-25℃).
12.2 Älä anna mikrokuoppien kuivua vaiheiden välillä epäonnistuneen toistettavuuden välttämiseksi ja käytä seuraavaa vaihetta välittömästi mikrokuoppien pidikkeen napautuksen jälkeen.
12.3 Ravista kutakin reagenssia kevyesti ennen käyttöä.
12.4 Pidä ihosi poissa pysäytysliuoksesta, sillä se on 0,5MH2SO4ratkaisu.
12.5 Älä käytä vanhentuneita sarjoja.Älä vaihda eri erien reagensseja, muuten herkkyys laskee.
12.6 Varastointiolosuhteet: Säilytä ELISA-sarjat 2-8 ℃:ssa, älä jäädytä.Sulje mikrokuoppalevyt. Vältä suoraa auringonvaloa kaikkien inkubaatioiden aikana.Mikrotiitterilevyjen peittämistä suositellaan.
12.7 Alustaliuos tulee jättää käyttämättä, jos se värjäytyy.Reagenssit voivat huonontua, jos nollastandardin absorbanssiarvo (450/630nm) on alle 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Väritysreaktio vaatii 15 minuuttia substraattiliuoksen lisäämisen jälkeen;Voit pidentää inkubointiaikaa vähintään 20 minuuttiin, jos väri on liian vaalea määritettäväksi. Älä koskaan ylitä 25 minuuttia. Päinvastoin, lyhennä inkubaatioaikaa kunnolla.
12.9 Optimaalinen reaktiolämpötila on 25 ℃.Korkeampi tai matalampi lämpötila johtaa herkkyys- ja absorbanssiarvojen muutoksiin.
12.Varastointitila ja -aika
Säilytystila: 2-8℃.
Varastointiaika: 12 kuukautta.
