produktua

1. 1.Aurrekariak

Nitrofuranoak espektro zabaleko antibiotiko sintetikoak dira, animalien ekoizpenean maiz erabiltzen direnak, bakterioen eta farmakokinetiko propietate bikainengatik.Hazkunde sustatzaile gisa ere erabili izan dira txerri, hegazti eta uretako ekoizpenean.Laborategiko animaliekin egindako epe luzeko ikerketetan, droga gurasoek eta haien metabolitoek ezaugarri kartzinogeno eta mutagenikoak erakusten zituzten.Horrek nitrofuranoak debekatzea ekarri du elikagaiak ekoizteko erabiltzen diren animaliak tratatzeko.Furaltadona, nitrofurantoina eta nitrofurazona nitrofurano sendagaiak debekatu egin ziren EBn 1993an elikagaien abereen ekoizpenean erabiltzea, eta 1995ean furazolidona erabiltzea debekatu zen.

Nitrofurano sendagaien hondakinen analisia nitrofuranoen droga nagusien ehunari loturiko metabolitoen detekzioan oinarritu behar da.Gurasoen drogak oso azkar metabolizatzen direnez eta ehunari lotuta dauden nitrofurano metabolitoak denbora luzez mantenduko direnez, metabolito hauek nitrofuranoen gehiegikeria detektatzeko helburu gisa erabiltzen dira, besteak beste, Furazolidone metabolitoa (AOZ), Furaltadone metabolitoa (AMOZ). ), Nitrofurantoina metabolitoa (AHD) eta Nitrofurazona metabolitoa (SEM).

AOZ-hondarrak LC-MS edo LC-MS/MS bidez zehazten dira gehienetan.Metodo kromatografikoekin alderatuta, immunoensayo entzimatikoek abantaila handiak erakusten dituzte sentsibilitateari, detekzio mugari, ekipamendu teknikoari eta denbora eskakizunari dagokionez.(Denbora kostua: 45min)

1. 2.Proba-printzipioa

ELISA kit hau AOZ detektatzeko diseinatuta dago, zeharkako lehiakortasun entzima-saio immunologikoaren printzipioan oinarrituta.Mikrotitulazio-putzuak harrapaketa BSAri lotutako antigenoz estalita daude.Laginean AOZ mikrotitulazio-plakan estalitako antigenoarekin lehiatzen da gehitutako antigorputzetarako.Entzima konjokatua gehitu ondoren, substratu kromogenikoa erabiltzen da eta seinalea espektrofotometro baten bidez neurtzen da.Xurgapena laginaren AOZ kontzentrazioarekiko alderantziz proportzionala da.

1. 3.Aplikazioak

Kit hau AOZ hondakinen analisi kuantitatibo eta kualitatiboetan erabil daitekeanima-ehunak(giharra, gibela eta abar), eztia.

1. 4.Erreakzio gurutzatuak

Furazolidonaren metabolitoa (AOZ)…………..%100

Furaltadonaren metabolitoa (AMOZ)…………………………<% 0,1

Nitrofurantoin metabolitoa (AHD)…………………………<% 0,1

Nitrofurazona metabolitoa (SEM)………...…<% 0,1

Furazolidona…………………………………………….…..…% 16,3

Furaltadona…………………………………………….…<%1

Nitrofurantoina…………………………………………….…….…<% 1

Nitrofurazona……………………………………………………..…<% 1

1. 5.Beharrezko materialak

5.1Ekipamenduak

----Mikrotitulazio plaka espektrofotometroa (450nm/630nm)

----Lurrungailu birakaria edo nitrogenoa lehortzeko tresnak

----Homogeneizatzailea/urdailua

----Shaker

----Vortex nahasgailua

---- Zentrifugatzailea

----Balantza analitikoa (induktantzia: 0,01 g)

----Pipeta graduatua: 10ml

----Gomazko pipeta-bonbilla

----Matraze bolumetrikoa: 100ml

----Beirazko matraza: 10ml

---- Poliestirenozko zentrifuga-hodia: 2ml, 50ml

----Mikropipetak: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Erreaktiboak

----Etil azetatoa (AR)

----n-hexanoa (edo n-heptanoa) (AR)

----Dipotasio hidrogeno fosfato trihidratoa

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Azido klorhidriko kontzentratua (HCl, AR)

-----Metanola

----Sodio hidroxidoa (NaOH, AR)

----Ura desionizatua

1. 6.Kitaren osagaiak

l Antigenoz estalitako mikrotitulazio-plaka, 96 putzu

l Soluzio estandarrak (6 botila, 1 ml/botila)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Spiking estandarraren kontrola: (1ml/botila).......100ppb

l Entzima konjokatu kontzentratua 1ml...... txapel gorria

l Entzima konjugatuen diluitzaileak 10 ml………..txapel berdea

l Substratua A 7ml………..............…....…..…..txapel zuria

l Substratua B 7ml………….............….........….…..txapel gorria

l Gelditu disoluzioa 7 ml…………………………… txano horia

l 20×garbiketa-soluzio kontzentratua 40ml

……………………………………………….……txapel gardena

l 2 × erauzketa-soluzio kontzentratua 60ml….txapel urdina

l 2-Nitrobenzaldehidoa 15,1 mg………………………… txapel zuria

1. 7.Erreaktiboak prestatzea

Irtenbidea 1: erreaktibo deribatua:

Gehitu 10 ml metanol 2-Nitrobenzaldehidoa duen botilara eta disolbatu.(10mM-ko kontzentrazioan).

Irtenbidea 2: 0,1 MK₂HPO₄irtenbidea:

22,8 g K pisatu₂HPO₄.3H₂O 1L ur deionizatuta disolbatzeko.

Irtenbidea 3: 1M HCl disoluzioa

Disolbatu 8,3 ml azido klorhidriko kontzentratua 100 ml-ra ur deionizatuarekin.

4. irtenbidea:1M NaOH disoluzioa

4g NaOH disolbatu 100 ml ur deionizatuarekin.

5. irtenbidea: erauzketa soluzioa:

Diluitu 2 × erauzketa kontzentratua ur deionizatuarekin 1:1 bolumen-erlazioan.Soluzio hau hilabetez kontserbatu daiteke 4 ℃-tan, laginak ateratzeko erabiliko dena.

Irtenbidea 6: garbiketa-soluzioa:

Diluitu 20 × garbiketa kontzentratua ur deionizatuarekin 1:19ko bolumen-errazioan, plakak garbitzeko erabiliko dena.Disoluzio diluitu hau hilabetez kontserba daiteke 4 ℃-tan.

1. 8.Laginak prestatzea

8.1Operazioaren aurretiko oharrak eta neurriak:

a) Mesedez, erabili behin-behineko aholkuak esperimentuan, eta aldatu aholkuak erreaktibo desberdinak xurgatzean.

b) Ziurtatu tresna esperimental guztiak garbi daudela.

c) erreaktibo deribatua 2-8 ℃-tan kontserba daiteke hiru hilabetez;

d) HCl disoluzioa giro-tenperaturan kontserbatu daiteke 3 hilabetez;

e) NaOH disoluzioa 3 hilabetez kontserba daiteke giro-tenperaturan;

f) Tratatu gabeko laginak izoztuta eduki (-20 ℃);

g) Tratatutako laginak 24 orduz kontserba daitezke 2-8 ℃ iluntasunean.

8.2 Animalien ehunen eta gibeleko laginak:

----Homogeneizatu laginak homogeneizatzailearekin;

---- Pisua 1,0 ± 0,05 g homogeneizatutako ehun laginaren 50 ml poliestirenozko zentrifuga-hodi batean.Gehitu 4 ml ur deionizatua, 0,5 ml 1M HCl disoluzioa eta 100ul erreaktibo deribatua (ikus 1. disoluzioa).Astindu 2 minutuz.

---- Inkubatu gauean 37 ℃-tan (16 ordu inguru);

---- Gehitu 5ml 0.1MK₂HPO₄ (irtenbidea2), 0,4 ml 1M NaOH (irtenbidea4) eta 5 ml etil azetatoa.Astindu gogor 30s;

---- Zentrifugatu giro-tenperaturan (20-25 ℃) 10 minutuz, gutxienez 3000 g;

---- Hartu 2,5 ml gaindiko fase organikotik 10 ml-ko beirazko hodi garbi batean, lehortu 50-60 ℃ nitrogeno gasarekin edo birakari lurrungailuarekin;

---- Desegin hondarra lehorra 1 ml n-hexano (edo n-heptanoarekin), zurrunbiloa 30 segundoz, gehitu 1 ml erauzketa soluzioa (irtenbidea5), 1min zurrunbiloa, nahastu guztiz.

---- Zentrifugatu giro-tenperaturan (20-25^oC) 5min, gutxienez 3000g;

---- Fase organiko gainditzailea kendu;hartu substratuaren ur-fasearen 50μl azterketarako.

8.4 Eztia

----pisatu 1,0±0,05g homogeneizatutako ezti laginaren 50 ml-ko poliestirenozko zentrifuga-hodi batean;

---- Gehitu 4 ml ur deionizatua, 0,5 ml 1M HCl (irtenbidea3) eta 100μl erreaktibo deribatua (irtenbidea1);astindu guztiz 2 minutuz;

----Inkubatu 37 ℃ gauean (16 ordu inguru);

----Gehitu 5ml 0.1MK₂HPO₄ (irtenbidea2), 0,4 ml 1M NaOH (irtenbidea4) eta 5 ml etil azetatoa, astindu gogor 30 segundoz;

---- Zentrifugatu giro-tenperaturan (20-25 ℃) 10 minutuz, gutxienez 3000 g;

----Hartu 2,5 ml gaindiko fase organikotik 10 ml-ko beirazko hodi garbi batean, lehortu 50-60 ℃ nitrogeno gasarekin edo lurrungailu birakariarekin;

---- Desegin hondarra lehorra 1 ml n-hexano (edo n-heptanoarekin), zurrunbiloa 30 segundoz, gehitu 1 ml erauzketa soluzioa (irtenbidea5), 1min zurrunbiloa, nahastu guztiz.

---- Zentrifugatu giro-tenperaturan (20-25^oC) 10min, gutxienez 3000g;

----Fase organiko gainditzailea kendu;hartu substratuaren ur-fasearen 50μl azterketarako.

1. 9.Entsegu prozesua

9.1Ohartu azterketaren aurretik

9.1.1 Ziurtatu erreaktibo eta mikroputzu guztiak giro-tenperaturan daudela (20-25 ℃).

9.1.2 Erabili eta berehala, gainerako erreaktibo guztiak 2-8 ℃-ra itzuli.

9.1.3 Mikroputzuak behar bezala garbitzea saiakuntza prozesuan urrats garrantzitsua da;ELISA analisiaren erreproduzigarritasunerako ezinbesteko faktorea da.

9.1.4 Inkubazioan argia saihestu eta mikroputzuak estali.

9.2 Saiaketaren urratsak

9.2.1 Atera erreaktibo guztiak giro-tenperaturan (20-25 ℃) 30 min baino gehiagoz, homogeneizatu erabili aurretik.

9.2.2 Atera behar diren mikroputzuak eta itzuli gainerakoa zip-lock-poltsan 2-8 ℃-ra berehala.

9.2.3 Garbiketa-soluzio kontzentratua eta erauzketa-soluzio kontzentratua berriro berotu behar dira giro-tenperaturan egon dadin erabili aurretik.

9.2.4Zenbakia:Mikroputzuen posizio guztiak zenbakituta eta estandar eta lagin guztiak bikoiztu egin behar dira.Grabatu estandarrak eta lagin-posizioak.

9.2.5Antigorputz kontzentratuaren disoluzioa diluitzea: diluitu entzima-disoluzio kontzentratua diluitzaile entzima konjokatuekin 1:10-ko bolumen-erlazioan (entzima-disoluzio kontzentratua 1 aldiz: 10 bider entzima-diluitzaile konjokatuekin).

9.2.6Gehitu disoluzio estandarra / lagina eta entzima konjugatu disoluzioa: gehitu 50 µl disoluzio estandar edo prestatutako lagina dagozkion putzuetan, gehitu 50 µl entzima konjugatu disoluzioa.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz astinduz eta inkubatu 30 minutuz 25 ℃-tan estalkiarekin.

9.2.7Garbitu: Kendu estalkia astiro-astiro eta isuri likidoa putzuetatik eta garbitu mikroputzuak 250 µl-ko disoluzio diluituarekin (irtenbidea6) 10 segundoko tartean 4-5 aldiz.Hondar-ura paper xurgatzailearekin xurgatu (gainerako aire-burbuila ezabatu daiteke erabili gabeko puntarekin).

9.2.8Kolorazioa: Gehitu 50µl substratu-disoluzioa A eta 50ul substratu-soluzioa B hobi bakoitzean.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz kulunkatuz eta inkubatu 15 minutuz 25 ℃-tan estalkiarekin (ikus 12.8).

9.2.11Neurria: Gehitu 50µl stop-soluzioa putzu bakoitzean.Nahastu astiro-astiro plaka eskuz kulunkatuz eta neurtu absorbantzia 450nm-an (450/630nm-ko uhin-luzera bikoitzean neurtzea iradoki zuen. Irakurri emaitza gelditzeko soluzioa gehitu eta 5 minutuko epean. )

10 Emaitzak

10.1Xurgapen ehunekoa

Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak lehen estandarraren (zero estandar) xurgantzia-balioarekin zatitzen dira eta % 100ean biderkatu.Zero estandarra % 100aren berdina egiten da eta absorbantzia-balioak ehunekotan adierazten dira.

=

B ——xurgantzia estandarra (edo lagina)

B0 ——absorbantzia zero estandarra

10.2Kurba Estandarra

----Kurba estandar bat marrazteko: Hartu estandarren absorbantzia-balioa y ardatz gisa, AOZ disoluzio estandarraren (ppb) kontzentrazio erdi logaritmikoa x ardatz gisa.

----Lagin bakoitzaren AOZ kontzentrazioa (ppb), kalibrazio-kurbatik irakur daitekeena, jarraitutako lagin bakoitzaren dagokion diluzio-faktorearekin biderkatzen da, eta laginaren benetako kontzentrazioa lortzen da.

Kontuan izan:

Datuen murrizketa guztietarako software berezia garatu da, eskaera eginda eman daitekeena.

Diluzio-faktorea…………………………………………………2

10.Sentikortasuna, zehaztasuna eta zehaztasuna

Sentikortasuna: 0,025 ppb

Detektatzeko muga:

Ehuna (giharra, gibela)………………………… 0,1 ppb

Eztia------------------------------------------------- -0,1 ppb

Zehaztasuna:

Animalien ehuna (giharra eta gibela)…………………% 100±20

Eztia………………………………..………….. 100±20%

Zehaztasuna:ELISA kitaren CVa % 10 baino txikiagoa da.

11.Oharra

12.1 Estandarretarako eta laginetarako lortutako absorbantzia-balioen batez besteko balioak murriztuko dira erreaktiboak eta laginak giro-tenperaturara erregulatu ez badira (20-25 ℃).

12.2 Ez utzi mikroputzuak lehortzen urratsen artean, arrakastarik gabeko erreproduzigarritasuna saihesteko eta egin hurrengo urratsa mikroputzuen euskarria kolpatu eta berehala.

12.3 Erabili aurretik, astindu leunki erreaktibo bakoitza.

12.4 Mantendu zure larruazala gelditzeko soluziotik 0,5MH-a delako₂SO₄irtenbidea.

12.5 Ez erabili kitak zaharkituta.Ez trukatu sorta desberdinetako erreaktiboak, bestela, sentsibilitatea jaitsi egingo da.

12.6 Biltegiratze-baldintza: mantendu ELISA kitak 2-8 ℃-tan, ez izoztu.Zigilatu gainerako mikroputzuen plakak, saihestu eguzki-argia zuzena inkubazio guztietan.Mikrotitulazioko plakak estaltzea gomendatzen da.

12.7 Substratuaren disoluzioa alde batera utzi behar da koloreak hartzen baditu.Erreaktiboak hondatu egin daitezke, zero estandarraren absorbantzia-balioa (450/630nm) 0,5 (A450nm<0,5) baino txikiagoa bada.

12.8 Kolorazio-erreakzioak 15 minutu behar ditu substratu-disoluzioa gehitu ondoren;Inkubazio-denbora 20min edo gehiago luza dezakezu kolore argiegia bada zehaztu behar bada., inoiz ez gainditu 25min. Aitzitik, laburtu inkubazio-denbora behar bezala.

12.9 Erreakzio-tenperatura optimoa 25 ℃ da.Tenperatura handiagoak edo baxuagoak sentikortasun eta absorbantzia balioen aldaketak ekarriko ditu.

12.Biltegiratze egoera eta biltegiratze epea

Biltegiratze egoera: 2-8 ℃.

Biltegiratzeko epea: 12 hilabete.