Seti ya Kinga ya Kinga ya Enzyme ya Ushindani kwa Uchambuzi wa Kiasi wa metabolite ya Furazolidone (AOZ)
Kifurushi cha Immunoassay cha Enzyme cha Ushindani cha
Uchambuzi wa Kiasi chaMetabolite ya Furazolidone(AOZ)
- 1.Usuli
Nitrofurani ni antibiotiki za wigo mpana za syntetisk, ambazo hutumiwa mara kwa mara katika uzalishaji wa wanyama kwa sifa zake bora za antibacterial na pharmacokinetic.Vile vile vilikuwa vimetumika kama wakuzaji ukuaji katika uzalishaji wa nguruwe, kuku na majini.Katika tafiti za muda mrefu na wanyama wa maabara zilionyesha kuwa dawa za wazazi na metabolites zao zilionyesha sifa za kansa na za mutagenic.Hii imesababisha kupigwa marufuku kwa nitrofuran kwa matibabu ya wanyama wanaotumiwa kwa uzalishaji wa chakula.Madawa ya nitrofurani furaltadone, nitrofurantoin na nitrofurazone yalipigwa marufuku kutumika katika uzalishaji wa wanyama katika Umoja wa Ulaya mwaka wa 1993, na matumizi ya furazolidone yalipigwa marufuku mwaka wa 1995.
Uchambuzi wa mabaki ya dawa za nitrofurani unahitaji kutegemea ugunduzi wa metabolites zilizofungwa kwenye tishu za dawa mama za nitrofurani.Kwa kuwa dawa kuu hutengenezwa kwa haraka sana, na metabolites za nitrofurani zilizofungwa kwenye tishu zitabaki kwa muda mrefu, metabolites hizi hutumiwa kama lengo la kugundua matumizi mabaya ya nitrofurani, ambayo ni pamoja na Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), metabolite ya Nitrofurantoin (AHD) na metabolite ya Nitrofurazone (SEM).
Mabaki ya AOZ hubainishwa zaidi na LC-MS au LC-MS/MS.Uchunguzi wa kinga ya enzyme, ikilinganishwa na mbinu za kromatografia, huonyesha faida kubwa kuhusu unyeti, kikomo cha kugundua, vifaa vya kiufundi na mahitaji ya wakati.(Gharama ya muda: 45min)
- 2.Kanuni ya Mtihani
Seti hii ya ELISA imeundwa kugundua AOZ kulingana na kanuni ya uchunguzi wa kinga ya kimeng'enya usio wa moja kwa moja.Visima vya microtiter vimefunikwa na antijeni iliyounganishwa na BSA.AOZ katika sampuli hushindana na antijeni iliyopakwa kwenye bati ndogo ya kingamwili inayoongezwa.Baada ya kuongezwa kwa conjugate ya enzyme, substrate ya chromogenic hutumiwa na ishara inapimwa na spectrophotometer.Unyonyaji huo unawiana kinyume na ukolezi wa AOZ kwenye sampuli.
- 3.Maombi
Seti hii inaweza kutumika katika uchanganuzi wa kiasi na ubora wa mabaki ya AOZ ndanitishu za uhuishaji(misuli, ini n.k), asali.
- 4.Miitikio mtambuka
Furazolidone metabolite (AOZ)……………………..100%
Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%
Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%
Nitrofurazoni metabolite (SEM)…………………………<0.1%
Furazolidone……………………………………………..… 16.3%
Furaltadone……………………………………………….…<1%
Nitrofurantoini…………………………………………….…<1%
Nitrofurazone……………………………………………..…<1%
- 5.Nyenzo Zinazohitajika
5.1Vifaa
----Kipima spectrophotometer ya sahani ndogo (450nm/630nm)
----Evaporator ya mzunguko au ala za kukausha naitrojeni
----Homogenizer /stomacher
----Mtikisaji
---- Mchanganyiko wa Vortex
----Kituo
----Salio la uchanganuzi (inductance: 0.01g)
----Pipette iliyohitimu: 10ml
----Balbu ya bomba la mpira
---- chupa ya volumetric: 100ml
---- chupa ya glasi: 10ml
----Polystyrene centrifuge tube: 2ml, 50ml
----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multipipette
5.2Vitendanishi
----Ethyl acetate (AR)
----n-hexane (au n-heptane) (AR)
----Dipotassium hidrojeni fosfati trihydrate
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Asidi hidrokloriki iliyokolea (HCl, AR)
-----Methanoli
----Hidroksidi ya sodiamu (NaOH, AR)
----Maji yaliyochanganyika
- 6.Vipengele vya Kit
l Sahani ya Microtiter iliyofunikwa na antijeni, visima 96
l Suluhisho za kawaida (chupa 6, 1ml / chupa)
0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb
l Udhibiti wa kiwango cha Spiking : (1ml/chupa).....100ppb
l Kimeng'enya kilichokolea huunganisha 1ml........ kofia nyekundu
l Enzyme conjugate diluents 10ml ……….. kofia ya kijani
l Substrate A 7ml ………………………..….. kofia nyeupe
l Substrate B 7ml …………………………………….. kofia nyekundu
l Suluhisho la 7ml ……………………………… kofia ya manjano
l 20 × ufumbuzi wa safisha ya kujilimbikizia 40ml
…………………………………………….kifuniko cha uwazi
l 2 × suluhisho la uchimbaji lililokolea 60ml…. kofia ya bluu
l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………… kofia nyeupe
- 7.Maandalizi ya Vitendanishi
Suluhisho 1: kitendanishi derivative:
Ongeza 10ml ya methanoli kwenye chupa yenye 2-Nitrobenzaldehyde na kuyeyusha.(katika mkusanyiko wa 10mM).
Suluhisho 2: 0.1MK2HPO4suluhisho:
Uzito 22.8g K2HPO4.3H2O hadi lita 1 ya maji yaliyotolewa ili kuyeyuka.
Suluhisho 3: Suluhisho la HCl la 1M
Futa 8.3ml Asidi hidrokloriki iliyokolea na maji yaliyotengwa hadi 100ml.
Suluhisho la 4:Suluhisho la 1M NaOH
Futa 4g NaOH kwa 100ml ya maji yaliyotolewa.
Suluhisho la 5: suluhisho la uchimbaji:
Punguza suluhisho la 2 × kujilimbikizia uchimbaji na maji yaliyotengwa kwa uwiano wa 1: 1.Suluhisho hili linaweza kuhifadhiwa kwa mwezi 1 kwa 4℃, ambalo litatumika kutoa sampuli.
Suluhisho 6: suluhisho la kuosha:
Punguza suluhisho la safisha la 20 × kujilimbikizia na maji yaliyotengwa kwa kiasi cha 1:19, ambayo itatumika kuosha sahani.Suluhisho hili la diluted linaweza kuhifadhiwa kwa mwezi 1 kwa 4 ℃.
- 8.Maandalizi ya Mfano
8.1Ilani na tahadhari kabla ya operesheni:
a) Tafadhali tumia vidokezo vya mara moja kwenye jaribio, na ubadilishe vidokezo wakati wa kunyonya kitendanishi tofauti.
b) Hakikisha kwamba zana zote za majaribio ni safi.
c) kitendanishi kinachotokana kinaweza kuhifadhiwa kwa 2-8℃ kwa miezi mitatu;
d) Suluhisho la HCl linaweza kuhifadhiwa kwa joto la kawaida kwa miezi 3;
e) Suluhisho la NaOH linaweza kuhifadhiwa kwa muda wa miezi 3 kwa joto la kawaida;
f) Weka sampuli ambazo hazijatibiwa kwenye kugandisha (-20℃);
g) Sampuli zilizotibiwa zinaweza kuhifadhiwa kwa saa 24 kwa 2-8℃ gizani.
8.2 Sampuli za tishu za wanyama na ini:
----Homogenize sampuli na homogenizer;
----Uzito 1.0±0.05g wa sampuli ya tishu iliyo na homojeni ndani ya 50ml polystyrene centrifuge tube.Ongeza 4ml ya maji yaliyotenganishwa, 0.5ml 1M suluhisho la HCl na reagent 100ul derivative (angalia suluhisho 1).Tikisa kwa dakika 2.
---- Inculate saa 37℃ usiku mmoja ( takriban 16h);
---- Ongeza 5ml 0.1MK2HPO4 (suluhisho2), 0.4ml 1M NaOH (suluhisho4) na 5ml ethyl acetate.Shake kwa ukali kwa 30s;
---- Centrifuge kwenye joto la kawaida (20-25℃) kwa dakika 10, angalau 3000g;
---- Chukua 2.5ml ya awamu ya kikaboni ya hali ya juu ndani ya bomba la glasi safi la 10ml, kavu na gesi ya nitrojeni ya 50-60℃ au kivukizo cha mzunguko;
Mimina mabaki makavu kwa 1ml n-hexane (au n- heptane), vortex kwa miaka 30, ongeza myeyusho wa 1ml (suluhisho5), vortex 1min, changanya kabisa.
---- Centrifuge kwenye joto la kawaida (20-25oC) kwa dakika 5, angalau 3000g;
---- Ondoa awamu ya kikaboni isiyo ya kawaida;chukua 50μl ya awamu ya maji ya substrate kwa uchunguzi.
8.4 Asali
----pima 1.0 ± 0.05g ya sampuli ya asali iliyo na homogenized kwenye tube ya polystyrene centrifuge ya 50ml;
----Ongeza 4ml maji yaliyotenganishwa, 0.5ml 1M HCl (suluhisho3) na kitendanishi cha 100μl (suluhisho1);kutikisa kabisa kwa dakika 2;
----Inculate saa 37℃ usiku mmoja (takriban 16h);
----Ongeza 5ml 0.1MK2HPO4 (suluhisho2), 0.4ml 1M NaOH (suluhisho4) na 5ml ethyl acetate, kutikisika kwa ukali kwa miaka 30;
----Centrifuge kwenye joto la kawaida (20-25℃) kwa dakika 10, angalau 3000g;
----Chukua 2.5ml ya awamu ya kikaboni ya hali ya juu ndani ya bomba la glasi safi la 10ml, kavu na gesi ya nitrojeni ya 50-60℃ au kivukizo cha mzunguko;
----Nyunyisha mabaki makavu kwa 1ml n-hexane (au n- heptane), vortex kwa miaka 30, ongeza myeyusho wa 1ml (suluhisho5), vortex 1min, changanya kabisa.
----Centrifuge kwenye joto la kawaida (20-25oC) kwa 10min, angalau 3000g;
----Ondoa awamu ya kikaboni isiyo ya kawaida;chukua 50μl ya awamu ya maji ya substrate kwa uchunguzi.
- 9.Mchakato wa uchambuzi
9.1Angalia kabla ya uchambuzi
9.1.1 Hakikisha vitendanishi na chembe ndogo zote ziko kwenye joto la kawaida (20-25℃).
9.1.2 Rejesha vitendanishi vyote vilivyosalia hadi 2-8℃ mara baada ya matumizi.
9.1.3 Kuosha microwells kwa usahihi ni hatua muhimu katika mchakato wa kupima;ni sababu muhimu kwa uzazi wa uchambuzi wa ELISA.
9.1.4 Epuka mwanga na funika visima vidogo wakati wa incubation.
9.2 Hatua za Upimaji
9.2.1 Ondoa vitendanishi vyote kwenye joto la kawaida (20-25℃) kwa zaidi ya dakika 30, homogenize kabla ya matumizi.
9.2.2 Toa visima vidogo vinavyohitajika na urudishe vingine kwenye mfuko wa kufunga zipu saa 2-8℃ mara moja.
9.2.3 Suluhisho la kuosha lililokolea na suluhisho la uchimbaji lililokolea linapaswa kuwashwa tena ili liwe kwenye joto la kawaida kabla ya matumizi.
9.2.4Nambari:Imeweka nambari kila nafasi ya visima vidogo na viwango vyote na sampuli zinapaswa kuendeshwa kwa nakala.Rekodi viwango na nafasi za sampuli.
9.2.5Dilution ya ufumbuzi wa kingamwili iliyokolea: punguza myeyusho wa kimeng'enya uliokolea na viyeyusho vya konjati ya kimeng'enya katika uwiano wa ujazo wa 1:10 (mmumusho wa kimeng'enya uliokolezwa mara 1: mikunjo 10 ya vimumunyisho vya konjati ya kimeng'enya).
9.2.6Ongeza suluhu/sampuli ya kawaida na suluhu ya muunganisho ya kimeng'enya: ongeza 50µl ya myeyusho wa kawaida au sampuli iliyotayarishwa kwa visima vinavyolingana, ongeza myeyusho wa mnyambuliko wa kimeng'enya cha 50µl.Changanya kwa upole kwa kutikisa sahani mwenyewe na uangulie kwa dakika 30 kwa joto la 25℃ na kifuniko.
9.2.7Osha: Ondoa kifuniko kwa upole na kumwaga kioevu kutoka kwenye visima na suuza microwells kwa 250µl suluhisho la kuosha lililo diluted (suluhisho6) kwa muda wa 10s kwa mara 4-5.Nywa maji yaliyobaki kwa karatasi ya kunyonya (puto la hewa lililobaki linaweza kuondolewa kwa ncha isiyotumika).
9.2.8Upakaji rangi: Ongeza myeyusho wa substrate ya 50µl A na mmumunyo wa 50ul wa substrate B kwa kila kisima.Changanya kwa upole kwa kutikisa sahani mwenyewe na uangulie kwa dakika 15 kwa joto la 25℃ na kifuniko (tazama 12.8).
9.2.11Pima: Ongeza 50µl suluhisho la kusimamisha kwa kila kisima.Changanya kwa upole kwa kutikisa sahani wewe mwenyewe na upime uwezo wa kunyonya kwa 450nm (Ilipendekeza kupima kwa urefu wa mawimbi mawili ya 450/630nm. Soma tokeo ndani ya dakika 5 baada ya kuongezwa kwa suluhisho la kusimama.)
10 Matokeo
10.1Asilimia ya kunyonya
Thamani za wastani za viwango vya kunyonya zilizopatikana kwa viwango na sampuli zimegawanywa na thamani ya kunyonya ya kiwango cha kwanza (kiwango cha sifuri) na kuzidishwa kwa 100%.Kwa hivyo, kiwango cha sifuri kinafanywa kuwa sawa na 100% na viwango vya kunyonya vimenukuliwa kwa asilimia.
=
B - kiwango cha kutokuwepo (au sampuli)
B0 --kupoteza kiwango cha sifuri
10.2Mviringo wa Kawaida
----Ili kuchora mduara wa kawaida: Chukua thamani ya ufyonzaji ya viwango kama mhimili y, nusu logarithmic ya mkusanyiko wa suluhisho la kawaida la AOZ (ppb) kama mhimili wa x.
----Mkusanyiko wa AOZ wa kila sampuli (ppb), unaoweza kusomwa kutoka kwenye kipingo cha urekebishaji, huzidishwa na kipengele cha dilution kinacholingana cha kila sampuli inayofuatwa, na mkusanyiko halisi wa sampuli hupatikana.
Tafadhali kumbuka:
Programu maalum imetengenezwa kwa upunguzaji wa data zote, ambazo zinaweza kutolewa kwa ombi.
Sababu ya dilution…………………………………………………2
10.Usikivu, usahihi na usahihi
Unyeti: 0.025ppb
Kikomo cha utambuzi:
Tishu (misuli, ini)…………………………….0.1ppb
Asali---------------------------------------------- -0.1ppb
Usahihi:
Tishu za wanyama (misuli na ini)……………………100±20%
Asali………………………………………………………. 100±20%
Usahihi:CV ya ELISA kit ni chini ya 10%.
11.Taarifa
12.1 Thamani za wastani za viwango vya kunyonya vilivyopatikana kwa viwango na sampuli zitapunguzwa ikiwa vitendanishi na sampuli hazijadhibitiwa kwa joto la kawaida ( 20-25 ℃).
12.2 Usiruhusu visima vidogo kukauka kati ya hatua ili kuepuka kuzaliana bila mafanikio na endesha hatua inayofuata mara baada ya kugonga kishikilia visima vidogo.
12.3 Tikisa kila kitendanishi taratibu kabla ya kutumia.
12.4 Weka ngozi yako mbali na kikomesha kwa kuwa ni 0.5MH2SO4suluhisho.
12.5 Usitumie vifaa vilivyopitwa na wakati.Usibadilishane vitendanishi vya bati tofauti, vinginevyo itapunguza usikivu.
12.6 Hali ya uhifadhi: Weka vifaa vya ELISA kwa 2-8℃, usigandishe.Ziba sahani ndogo za kupumzika, Epuka jua moja kwa moja wakati wa incubations zote.Inashauriwa kufunika sahani za microtiter.
12.7 Suluhisho la substrate linapaswa kuachwa ikiwa linageuka rangi.Vitendanishi vinaweza kuharibika ikiwa thamani ya kunyonya (450/630nm) ya kiwango cha sifuri ni chini ya 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 Mmenyuko wa rangi unahitaji dakika 15 baada ya kuongeza suluhisho la substrate;Unaweza kuongeza muda wa incubation hadi 20min au zaidi ikiwa rangi ni nyepesi sana kuamua., usizidi 25min. Badala yake, fupisha muda wa incubation vizuri.
12.9 Joto bora la mmenyuko ni 25℃.Joto la juu au la chini litasababisha mabadiliko ya unyeti na maadili ya kunyonya.
12.Hali ya uhifadhi na muda wa kuhifadhi
Hali ya uhifadhi: 2-8 ℃.
Muda wa Uhifadhi: Miezi 12.
