produkt

1. 1.Bakgrunn

Nitrofuraner er syntetiske bredspektrede antibiotika, som ofte brukes i dyreproduksjon for sine utmerkede antibakterielle og farmakokinetiske egenskaper.De hadde også blitt brukt som vekstfremmere i svine-, fjærfe- og akvatisk produksjon.I langtidsstudier med laboratoriedyr indikerte moderlegemidlene og deres metabolitter kreftfremkallende og mutagene egenskaper.Dette har ført til et forbud mot nitrofuraner til behandling av dyr som brukes til matproduksjon.Nitrofuranmedikamentene furaltadon, nitrofurantoin og nitrofurazon ble forbudt å bruke i matdyrproduksjon i EU i 1993, og bruk av furazolidon ble forbudt i 1995.

Analysen av rester av nitrofuranmedikamenter må være basert på påvisning av de vevsbundne metabolittene til moderlegemidlene til nitrofuran.Siden stammedikamentene metaboliseres veldig raskt, og de vevsbundne nitrofuranmetabolittene vil beholdes i lang tid, brukes disse metabolittene som mål for påvisning av misbruk av nitrofuraner, som inkluderer Furazolidon-metabolitt (AOZ), Furaltadon-metabolitt (AMOZ) ), Nitrofurantoin-metabolitt (AHD) og Nitrofurazon-metabolitt (SEM).

AOZ-rester bestemmes oftest av LC-MS eller LC-MS/MS.Enzymimmunanalyser, sammenlignet med kromatografiske metoder, viser betydelige fordeler med hensyn til sensitivitet, deteksjonsgrense, teknisk utstyr og tidsbehov.(Tidskostnad: 45 min)

1. 2.Testprinsipp

Dette ELISA-settet er designet for å oppdage AOZ basert på prinsippet om indirekte konkurrerende enzymimmunoassay.Mikrotiterbrønnene er belagt med BSA-bundet antigen.AOZ i prøven konkurrerer med antigenet som er belagt på mikrotiterplaten om det tilsatte antistoffet.Etter tilsetning av enzymkonjugat brukes kromogent substrat og signalet måles med et spektrofotometer.Absorpsjonen er omvendt proporsjonal med AOZ-konsentrasjonen i prøven.

1. 3.applikasjoner

Dette settet kan brukes i kvantitativ og kvalitativ analyse av AOZ-rester ianima vev(muskler, lever etc), honning.

1. 4.Kryssreaksjoner

Furazolidon-metabolitt (AOZ) …………………………..100 %

Furaltadon-metabolitt (AMOZ)………………………<0,1 %

Nitrofurantoinmetabolitt (AHD)…………………………<0,1 %

Nitrofurazonmetabolitt (SEM)……………………………<0,1 %

Furazolidon………………………………………………………..…16,3 %

Furaltadon……………………………………………………….…<1 %

Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1 %

Nitrofurazon…………………………………………………..…<1 %

1. 5.Materialer som kreves

5.1Utstyr

---- Mikrotiterplatespektrofotometer (450nm/630nm)

---- Roterende fordamper eller nitrogentørkeinstrumenter

---- Homogenisator / mage

----Shaker

----Vortex mikser

---- Sentrifuger

----Analytisk balanse (induktans: 0,01g)

---- Gradert pipette: 10ml

----Gummipipettepære

----Volumetrisk kolbe: 100ml

----Glasskolbe: 10ml

----Polystyren sentrifugerør: 2ml, 50ml

----Mikropipetter: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagenser

---- Etylacetat (AR)

----n-heksan (eller n-heptan) (AR)

---- Dikaliumhydrogenfosfattrihydrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Konsentrert saltsyre (HCl, AR)

----- Metanol

---- Natriumhydroksid (NaOH, AR)

----Avionisert vann

1. 6.Kitkomponenter

l Mikrotiterplate belagt med antigen, 96 brønner

l Standardløsninger (6 flasker, 1 ml/flaske)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Spiking standard kontroll: (1ml/flaske)....….100 ppb

l Konsentrert enzymkonjugat 1ml……..rød kork

l Enzymkonjugatfortynningsmidler 10ml………..grønn kapsel

l Substrat A 7ml………………………………………………..…..hvit hette

l Substrat B 7ml……………………………………………….…..rød hette

l Stoppløsning 7ml………………………………… gul hette

l 20×konsentrert vaskeløsning 40ml

………………………………………….……gjennomsiktig hette

l 2×konsentrert ekstraksjonsløsning 60ml….blå hette

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1mg………………hvit hette

1. 7.Forberedelse av reagenser

Løsning 1: derivatreagens:

Tilsett 10 ml metanol til flasken med 2-nitrobenzaldehyd og løs opp.(ved konsentrasjonen 10 mM).

Løsning 2: 0,1 MK₂HPO₄løsning:

Vekt 22,8g K₂HPO₄.3H₂O til 1L avionisert vann for å oppløses.

Løsning 3: 1M HCl-løsning

Løs opp 8,3 ml konsentrert saltsyre med avionisert vann til 100 ml.

Løsning 4:1M NaOH-løsning

Løs opp 4 g NaOH med 100 ml avionisert vann.

Løsning 5: ekstraksjonsløsning:

Fortynn 2×konsentrert ekstraksjonsløsning med avionisert vann i volumforholdet 1:1.Denne løsningen kan lagres i 1 måned ved 4 ℃, som vil bli brukt til å trekke ut prøver.

Løsning 6: vaskeløsning:

Fortynn den 20×konsentrerte vaskeløsningen med avionisert vann i volumforholdet 1:19, som skal brukes til å vaske platene.Denne fortynnede løsningen kan lagres i 1 måned ved 4 ℃.

1. 8.Prøveforberedelser

8.1Merknad og forholdsregler før bruk:

a) Vennligst bruk engangsspisser i eksperimentet, og bytt spissene når du absorberer forskjellige reagenser.

b) Sørg for at alle eksperimentelle instrumenter er rene.

c) derivatreagenset kan konserveres ved 2-8 ℃ i tre måneder;

d) HCl-løsningen kan konserveres ved romtemperatur i 3 måneder;

e) NaOH-løsningen kan konserveres i 3 måneder ved romtemperatur;

f) Hold ubehandlede prøver i frys (-20 ℃);

g) Behandlede prøver kan lagres i 24 timer ved 2-8 ℃ i mørke.

8.2 Dyrevev og leverprøver:

---- Homogeniser prøvene med homogenisator;

---- Vekt 1,0±0,05 g av den homogeniserte vevsprøven i 50 ml polystyren sentrifugerør.Tilsett 4 ml avionisert vann, 0,5 ml 1M HCl-løsning og 100 ul derivatreagens (se løsning 1).Rist den i 2 min.

---- Inkuber ved 37 ℃ over natten (ca. 16 timer);

---- Legg til 5ml 0,1MK₂HPO₄ (løsning2), 0,4 ml 1 M NaOH (løsning4) og 5 ml etylacetat.Rist heftig i 30-årene;

---- Sentrifuger ved romtemperatur (20-25 ℃) i 10 minutter, minst 3000g;

---- Ta 2,5 ml av supernatantens organiske fase inn i et 10 ml rent glassrør, tørk med 50-60 ℃ nitrogengass eller rotasjonsfordamper;

---- Løs opp den tørre resten med 1 ml n-heksan (eller n-heptan), vortex i 30 sekunder, tilsett 1 ml ekstraksjonsløsning (løsning5), vortex 1 min, bland helt.

---- Sentrifuger ved romtemperatur (20-25^oC) i 5 minutter, minst 3000g;

---- Fjern supernatantens organiske fase;ta 50 μl av substratvannfasen for analyse.

8.4 Honning

---- vei 1,0±0,05 g av den homogeniserte honningprøven i et 50 ml polystyren sentrifugerør;

----Tilsett 4 ml avionisert vann, 0,5 ml 1M HCl (løsning3) og 100 μl derivatreagens (løsning1);rist helt i 2 minutter;

---- Inkuber ved 37 ℃ over natten (ca. 16 timer);

----Tilsett 5ml 0,1MK₂HPO₄ (løsning2), 0,4 ml 1 M NaOH (løsning4) og 5 ml etylacetat, rist kraftig i 30 sekunder;

---- Sentrifuger ved romtemperatur (20-25 ℃) i 10 minutter, minst 3000g;

----Ta 2,5 ml av supernatantens organiske fase inn i et 10 ml rent glassrør, tørk med 50-60 ℃ nitrogengass eller rotasjonsfordamper;

---- Løs opp den tørre resten med 1 ml n-heksan (eller n-heptan), vortex i 30 sekunder, tilsett 1 ml ekstraksjonsløsning (løsning5), vortex 1 min, bland helt.

---- Sentrifuger ved romtemperatur (20-25^oC) i 10 minutter, minst 3000g;

---- Fjern supernatantens organiske fase;ta 50 μl av substratvannfasen for analyse.

1. 9.Analyseprosess

9.1Legg merke til før analyse

9.1.1 Sørg for at alle reagenser og mikrobrønner er i romtemperatur (20-25 ℃).

9.1.2 Sett alle de resterende reagensene tilbake til 2-8 ℃ umiddelbart etter bruk.

9.1.3 Å vaske mikrobrønnene riktig er et viktig trinn i analysen;det er den avgjørende faktoren for reproduserbarheten av ELISA-analysen.

9.1.4 Unngå lyset og dekk til mikrobrønnene under inkubasjonen.

9.2 Analysetrinn

9.2.1 Ta ut alle reagenser ved romtemperatur (20-25 ℃) i mer enn 30 minutter, homogeniser før bruk.

9.2.2 Få ut de nødvendige mikrobrønnene og legg resten tilbake i zip-lock-posen ved 2-8 ℃ umiddelbart.

9.2.3 Den konsentrerte vaskeløsningen og den konsentrerte ekstraksjonsløsningen bør varmes opp igjen til romtemperatur før bruk.

9.2.4Antall:Nummerert hver mikrobrønnposisjon og alle standarder og prøver skal kjøres i duplikat.Registrer standardene og prøveposisjonene.

9.2.5Fortynning av konsentrert antistoffløsning: Fortynn den konsentrerte enzymløsningen med enzymkonjugatfortynningsmidler i volumforholdet 1:10 (1 ganger konsentrert enzymløsning: 10 ganger enzymkonjugatfortynningsmidler).

9.2.6Tilsett standardløsning/prøve og enzymkonjugatløsning: tilsett 50 µl standardløsning eller klargjort prøve til tilsvarende brønner, tilsett 50 µl enzymkonjugatløsning.Bland forsiktig ved å riste platen manuelt og inkuber i 30 minutter ved 25 ℃ med lokk.

9.2.7Vask: Fjern dekselet forsiktig og hell væsken ut av brønnene og skyll mikrobrønnene med 250 µl fortynnet vaskeløsning (løsning6) med intervaller på 10 sekunder i 4-5 ganger.Absorber gjenværende vann med absorberende papir (resten luftboble kan elimineres med ubrukt spiss).

9.2.8Farging: Tilsett 50 µl substratløsning A og 50 ul substratløsning B til hver brønn.Bland forsiktig ved å vippe platen manuelt og inkuber i 15 minutter ved 25 ℃ med deksel (se 12.8).

9.2.11Måle: Tilsett 50 µl stoppløsningen til hver brønn.Bland forsiktig ved å vippe platen manuelt og mål absorbansen ved 450 nm (Det foreslo mål med dobbel bølgelengde på 450/630 nm. Les resultatet innen 5 minutter etter tilsetning av stoppløsning. )

10 Resultater

10.1Prosentvis absorbans

Gjennomsnittsverdiene for absorbansverdiene oppnådd for standardene og prøvene er delt på absorbansverdien til den første standarden (nullstandard) og multiplisert med 100 %.Nullstandarden er dermed lik 100 % og absorbansverdiene er oppgitt i prosent.

=

B ——absorbansstandard (eller prøve)

B0 ——absorbans null standard

10.2Standard kurve

----For å tegne en standardkurve: Ta absorbansverdien til standarder som y-akse, semilogaritmisk av konsentrasjonen av AOZ-standardløsningen (ppb) som x-akse.

---- AOZ-konsentrasjonen til hver prøve (ppb), som kan leses fra kalibreringskurven, multipliseres med den tilsvarende fortynningsfaktoren for hver prøve som følges, og den faktiske konsentrasjonen av prøven oppnås.

Vennligst legg merke til:

Det er utviklet spesialprogramvare for all datareduksjon, som kan leveres på forespørsel.

Fortynningsfaktor…………………………………………..……2

10.Følsomhet, nøyaktighet og presisjon

Følsomhet: 0,025 ppb

Deteksjonsgrense:

Vev (muskel, lever)…………………………0.1ppb

Honning------------------------------------------------- -0,1 ppb

Nøyaktighet:

Dyrevev (muskler og lever)…………………………100±20 %

Honning………………………………..……………….... 100±20 %

Presisjon:CV for ELISA-settet er mindre enn 10 %.

11.Legge merke til

12.1 Gjennomsnittsverdiene for absorbansverdiene oppnådd for standardene og prøvene vil bli redusert dersom reagensene og prøvene ikke er regulert til romtemperatur (20-25 ℃).

12.2 Ikke la mikrobrønnene tørke mellom trinnene for å unngå mislykket reproduserbarhet, og utfør neste trinn umiddelbart etter at du har banket på mikrobrønnholderen.

12.3 Rist hver reagens forsiktig før bruk.

12.4 Hold huden unna stoppløsningen, for det er 0,5MH₂SO₄løsning.

12.5 Ikke bruk settene utdatert.Ikke bytt ut reagensene til forskjellige partier, ellers vil det redusere følsomheten.

12.6 Oppbevaringsforhold: Hold ELISA-settene ved 2-8 ℃, ikke frys.Forsegl hvile mikrobrønnplater, Unngå direkte sollys under alle inkubasjoner.Det anbefales å dekke til mikrotiterplatene.

12.7 Substratløsning bør forlates hvis den får farger.Reagensene kan bli forringet hvis absorbansverdien (450/630 nm) til nullstandarden er mindre enn 0,5 (A450 nm<0,5).

12.8 Fargingsreaksjonen trenger 15 minutter etter tilsetning av substratløsning;Du kan forlenge inkubasjonstiden til 20 minutter eller mer hvis fargen er for lys til å kunne bestemmes., aldri overskride 25 minutter. Tvert imot, forkort inkubasjonstiden skikkelig.

12.9 Den optimale reaksjonstemperaturen er 25 ℃.Høyere eller lavere temperatur vil føre til endringer i følsomhets- og absorbansverdier.

12.Lagringstilstand og oppbevaringsperiode

Lagringstilstand: 2-8 ℃.

Lagringstid: 12 måneder.