prodott

1. 1.Sfond

In-nitrofurans huma antibijotiċi sintetiċi ta 'spettru wiesa', li huma ta 'spiss impjegati fil-produzzjoni tal-annimali għall-proprjetajiet antibatteriċi u farmakokinetiċi eċċellenti tiegħu.Kienu wkoll użati bħala promoturi tat-tkabbir fil-produzzjoni tal-ħnieżer, tat-tjur u akkwatika.Fi studji fit-tul b'annimali tal-laboratorju indikaw li l-mediċini ġenituri u l-metaboliti tagħhom wrew karatteristiċi karċinoġeniċi u mutaġeniċi.Dan wassal għal projbizzjoni tan-nitrofurans għat-trattament tal-annimali użati għall-produzzjoni tal-ikel.Id-drogi nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin u nitrofurazone ġew ipprojbiti mill-użu fil-produzzjoni tal-annimali tal-ikel fl-UE fl-1993, u l-użu ta 'furazolidone kien ipprojbit fl-1995.

L-analiżi tar-residwu tad-drogi nitrofuran jeħtieġ li tkun ibbażata fuq l-iskoperta tal-metaboliti marbuta mat-tessuti tal-mediċini ġenituri nitrofuran.Peress li l-mediċini ġenituri huma metabolizzati malajr ħafna, u l-metaboliti tan-nitrofuran marbuta mat-tessut se jżommu għal żmien twil, dawn il-metaboliti jintużaw bħala l-mira fl-iskoperta tal-abbuż ta 'nitrofurans, li jinkludu l-metabolit ta' Furazolidone (AOZ), il-metabolit ta 'Furaltadone (AMOZ). ), metabolit Nitrofurantoin (AHD) u metabolit Nitrofurazone (SEM).

Ir-residwi AOZ huma determinati l-aktar b'mod komuni minn LC-MS jew LC-MS/MS.L-immunoassaġġi tal-enżimi, meta mqabbla mal-metodi kromatografiċi, juru vantaġġi konsiderevoli fir-rigward tas-sensittività, il-limitu ta 'skoperta, it-tagħmir tekniku u l-ħtieġa ta' ħin.(L-ispiża tal-ħin: 45min)

1. 2.Prinċipju tat-Test

Dan il-kit ELISA huwa ddisinjat biex jikxef AOZ ibbażat fuq il-prinċipju ta 'immunoassay ta' enżimi kompetittivi indiretti.Il-bjar tal-mikrotiter huma miksija b'antiġen tal-qbid marbut mal-BSA.AOZ fil-kampjun jikkompeti mal-antiġen miksi fuq il-pjanċa tal-mikrotiter għall-antikorp miżjud.Wara ż-żieda ta 'konjugat ta' enzima, jintuża substrat kromoġeniku u s-sinjal jitkejjel bi spettrofotometru.L-assorbiment huwa inversament proporzjonali għall-konċentrazzjoni AOZ fil-kampjun.

1. 3.Applikazzjonijiet

Dan il-kit jista 'jintuża f'analiżi kwantitattiva u kwalitattiva ta' residwu AOZ fitessuti anima(muskoli, fwied eċċ), għasel.

1. 4.Reazzjonijiet inkroċjati

Metabolit ta' Furazolidone (AOZ)………………………………..100%

Metabolit tal-furaltadone (AMOZ)…………………………<0.1%

Metabolit tan-nitrofurantoin (AHD)…………………………<0.1%

Metabolit tan-nitrofurazone (SEM)………...…<0.1%

Furazolidone…………………………………………….…..…16.3%

Furaltadone…………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Materjali Meħtieġa

5.1Tagħmir

---- Spettrofotometru tal-pjanċa tal-mikrotiter (450nm/630nm)

---- Evaporatur li jdur jew strumenti tat-tnixxif tan-nitroġenu

----Omoġenizzatur /stomacher

----Shaker

---- Vortex mixer

---- Ċentrifuga

---- Bilanċ analitiku (inductance: 0.01g)

---- Pipetta gradwata: 10ml

---- Bozza tal-pipetta tal-gomma

----Flask volumetriku: 100ml

----Flask tal-ħġieġ: 10ml

----Tubu ċentrifugu tal-polistirene: 2ml, 50ml

---- Mikropipetti: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reaġenti

----Etil aċetat (AR)

----n-hexane (jew n-heptane) (AR)

---- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Aċidu idrokloriku kkonċentrat (HCl, AR)

-----Metanol

---- Idrossidu tas-sodju (NaOH, AR)

----Ilma dejonizzat

1. 6.Komponenti tal-Kit

l Pjanċa tal-mikrotiter miksija b'antiġen, 96 ħjar

l Soluzzjonijiet standard (6 fliexken, 1ml/flixkun)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Kontroll standard ta 'spiking: (1ml/flixkun)....….100ppb

l Konjugat ta' l-enżima ikkonċentrat 1ml....... għatu aħmar

l Dilwenti konjugati tal-enżimi 10ml………..għatu aħdar

l Substrat A 7ml……….............…....…..…..tapp abjad

l Substrat B 7ml……….............…........….…..tapp aħmar

l Soluzzjoni ta' waqfien 7ml…………………………… għatu isfar

l 20 × soluzzjoni tal-ħasil konċentrata 40ml

…………………………………….……tapp trasparenti

l 2 × soluzzjoni ta 'estrazzjoni kkonċentrata 60ml….tapp blu

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………………… għatu abjad

1. 7.Preparazzjoni tar-reaġenti

Soluzzjoni 1: reaġent derivattiv:

Żid 10ml ta' metanol mal-flixkun li jkollu 2-Nitrobenzaldehyde u ħoll.(fil-konċentrazzjoni ta '10mM).

Soluzzjoni 2: 0.1MK₂HPO₄soluzzjoni:

Iżen 22.8g K₂HPO₄.3H₂O sa 1L ta 'ilma dejonizzat biex jinħall.

Soluzzjoni 3: Soluzzjoni 1M HCl

Dewweb 8.3ml Aċidu idrokloriku kkonċentrat b'ilma dejonizzat għal 100ml.

Soluzzjoni 4:Soluzzjoni 1M NaOH

Dewweb 4g NaOH b'100ml ilma dejonizzat.

Soluzzjoni 5: soluzzjoni ta' estrazzjoni:

Iddilwa 2 × soluzzjoni ta 'estrazzjoni kkonċentrata b'ilma dejonizzat fil-proporzjon tal-volum ta' 1:1.Din is-soluzzjoni tista 'tiġi kkonservata għal xahar f'4℃, li se tintuża għall-kampjuni estratti.

Soluzzjoni 6: soluzzjoni tal-ħasil:

Iddilwa s-soluzzjoni tal-ħasil 20 × konċentrata b'ilma dejonizzat fir-razzjon tal-volum ta '1:19, li se jintuża biex taħsel il-pjanċi.Din is-soluzzjoni dilwita tista 'tiġi kkonservata għal xahar f'4℃.

1. 8.Preparazzjonijiet tal-Kampjuni

8.1Avviż u prekawzjonijiet qabel l-operazzjoni:

a) Jekk jogħġbok uża ponot ta 'darba fl-esperiment, u ibdel il-ponot meta tassorbi reaġent differenti.

b) Kun żgur li l-istrumenti sperimentali kollha huma nodfa.

c) ir-reaġent derivattiv jista 'jiġi kkonservat f'2-8℃ għal tliet xhur;

d) Is-soluzzjoni ta 'HCl tista' tiġi kkonservata f'temperatura tal-kamra għal 3 xhur;

e) Is-soluzzjoni ta 'NaOH tista' tiġi kkonservata għal 3 xhur f'temperatura tal-kamra;

f) Żomm kampjuni mhux ittrattati fil-friża (-20℃);

g) Il-kampjuni ttrattati jistgħu jiġu kkonservati għal 24 siegħa f'2-8℃ fid-dlam.

8.2 Tessut ta' l-annimali u kampjuni tal-fwied:

----Omoġenizza l-kampjuni b'omoġenizzatur;

---- Piż 1.0±0.05g tal-kampjun tat-tessut omoġenizzat f'tubu ċentrifugu tal-polistirene ta '50ml.Żid 4ml ilma dejonizzat, 0.5ml 1M HCl soluzzjoni u 100ul reaġent derivattiv (ara soluzzjoni 1).Ħawwad għal 2min.

---- Inkuba f'37℃ matul il-lejl (madwar 16h);

---- Żid 5ml 0.1MK₂HPO₄ (soluzzjoni2), 0.4ml 1M NaOH (soluzzjoni4) u 5ml aċetat etiliku.Ħawwad bil-biża għal 30s;

---- Iċċentrifuga f'temperatura tal-kamra (20-25℃) għal 10min, mill-inqas 3000g;

---- Ħu 2.5ml tal-fażi organika supernatant f'tubu tal-ħġieġ nadif ta '10ml, nixxef b'gass tan-nitroġenu ta' 50-60℃ jew evaporatur li jdur;

---- Dewweb il-fdal niexef b'1ml n-hexane (jew n-heptane), vortex għal 30s, żid 1ml soluzzjoni ta' estrazzjoni (soluzzjoni5), vortex 1min, ħallat kompletament.

---- Iċċentrifuga f'temperatura tal-kamra (20-25^oC) għal 5min, mill-inqas 3000g;

---- Neħħi l-fażi organika supernatant;ħu 50μl tal-fażi tal-ilma tas-sottostrat għall-assaġġ.

8.4 Għasel

---- iżen 1.0±0.05g tal-kampjun tal-għasel omoġenizzat f'tubu ċentrifugu tal-polistirene ta '50ml;

---- Żid 4ml ilma dejonizzat, 0.5ml 1M HCl (soluzzjoni3) u 100μl reaġent derivattiv (soluzzjoni1);ħawwad kompletament għal 2min;

---- Inkuba f'37℃ matul il-lejl (madwar 16h);

---- Żid 5ml 0.1MK₂HPO₄ (soluzzjoni2), 0.4ml 1M NaOH (soluzzjoni4) u 5ml ethyl acetate, ħawwad bil-biża għal 30s;

---- Iċċentrifuga f'temperatura tal-kamra (20-25℃) għal 10min, mill-inqas 3000g;

---- Ħu 2.5ml tal-fażi organika supernatant f'tubu tal-ħġieġ nadif ta '10ml, nixxef b'gass tan-nitroġenu ta' 50-60℃ jew evaporatur li jdur;

---- Dewweb il-fdal niexef b'1ml n-hexane (jew n-heptane), vortex għal 30s, żid 1ml soluzzjoni ta' estrazzjoni (soluzzjoni5), vortex 1min, ħallat kompletament.

---- Iċċentrifuga f'temperatura tal-kamra (20-25^oC) għal 10min, mill-inqas 3000g;

---- Neħħi l-fażi organika supernatant;ħu 50μl tal-fażi tal-ilma tas-sottostrat għall-assaġġ.

1. 9.Proċess tal-assaġġ

9.1Avviż qabel l-assaġġ

9.1.1 Kun żgur li r-reaġenti u l-mikrowells kollha jkunu kollha f'temperatura tal-kamra (20-25℃).

9.1.2 Irritorna r-reaġenti kollha tal-bqija għal 2-8℃ immedjatament wara l-użu.

9.1.3 Il-ħasil tal-mikrowells b'mod korrett huwa pass importanti fil-proċess tal-assaġġ;huwa l-fattur vitali għar-riproduċibbiltà tal-analiżi ELISA.

9.1.4 Evita d-dawl u għatti l-microwells waqt l-inkubazzjoni.

9.2 Passi tal-Assaġġ

9.2.1 Oħroġ ir-reaġenti kollha f'temperatura tal-kamra (20-25 ℃) għal aktar minn 30min, omoġenizza qabel l-użu.

9.2.2 Oħroġ il-microwells meħtieġa u rritorna l-bqija fil-borża zip-lock f'2-8℃ immedjatament.

9.2.3 Is-soluzzjoni tal-ħasil konċentrata u s-soluzzjoni ta 'estrazzjoni kkonċentrata għandhom jissaħħan mill-ġdid biex ikunu f'temperatura tal-kamra qabel l-użu.

9.2.4Numru:Kull pożizzjonijiet tal-mikrowell numerati u l-istandards u l-kampjuni kollha għandhom jitħaddmu f'żewġ kopji.Irreġistra l-istandards u l-pożizzjonijiet tal-kampjuni.

9.2.5Dilwizzjoni ta' soluzzjoni ta' antikorpi kkonċentrata: iddilwixxi s-soluzzjoni ta 'enżima kkonċentrata b'dilwenti konjugati ta' l-enżimi fil-proporzjon tal-volum ta '1:10 (soluzzjoni ta' enżima kkonċentrata 1 darbiet: dilwenti konjugati ta 'enżimi 10 darbiet).

9.2.6Żid soluzzjoni standard / kampjun u soluzzjoni konjugata ta 'enżima: żid 50µl ta' soluzzjoni standard jew kampjun ippreparat fil-bjar korrispondenti, żid 50µl soluzzjoni ta' konjugat tal-enżimi.Ħallat bil-mod billi tħawwad il-pjanċa manwalment u inkuba għal 30min f'25℃ b'għatu.

9.2.7Aħsel: Neħħi l-għatu bil-mod u ferra l-likwidu mill-bjar u laħlaħ il-microwells b’250µl soluzzjoni tal-ħasil dilwita (soluzzjoni6) f'intervall ta '10s għal 4-5 darbiet.Assorbi l-ilma residwu b'karta assorbenti (il-bużżieqa ta 'l-arja tal-bqija tista' tiġi eliminata bil-ponta mhux użata).

9.2.8Kulur: Żid 50µl soluzzjoni ta' substrat A u 50ul ta' soluzzjoni ta' substrat B ma' kull bir.Ħallat bil-mod billi tbandal il-pjanċa manwalment u inkuba għal 15-il minuta f'25℃ b'għatu (ara 12.8).

9.2.11Miżura: Żid 50µl is-soluzzjoni ta' waqfien f'kull bir.Ħallat bil-mod billi tbandal il-pjanċa manwalment u kejjel l-assorbenza f'450nm (Hija ssuġġeriet miżura b'tul ta 'mewġ doppju ta' 450/630nm. Aqra r-riżultat fi żmien 5min wara ż-żieda ta 'soluzzjoni ta' waqfien. )

10 Riżultati

10.1Assorbenza perċentwali

Il-valuri medji tal-valuri ta' assorbiment miksuba għall-istandards u l-kampjuni huma diviżi bil-valur ta' assorbiment ta' l-ewwel standard (standard żero) u mmultiplikati b'100%.L-istandard żero għalhekk isir ugwali għal 100% u l-valuri ta' assorbiment huma kkwotati f'perċentwali.

=

B ——standard ta' assorbiment (jew kampjun)

B0 ——assorbenza żero standard

10.2Kurva Standard

---- Biex tiġbed kurva standard: Ħu l-valur ta 'assorbiment ta' standards bħala assi y, semi-logaritmiku tal-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni standard AOZ (ppb) bħala assi x.

---- Il-konċentrazzjoni AOZ ta 'kull kampjun (ppb), li tista' tinqara mill-kurva tal-kalibrazzjoni, hija mmultiplikata bil-fattur ta 'dilwizzjoni korrispondenti ta' kull kampjun segwit, u tinkiseb il-konċentrazzjoni attwali tal-kampjun.

Jekk jogħġbok innota:

Ġie żviluppat softwer speċjali għat-tnaqqis tad-dejta kollu, li jista 'jiġi pprovdut fuq talba.

Fattur ta' dilwizzjoni………………………………………..……2

10.Sensittività, preċiżjoni u preċiżjoni

Sensittività: 0.025ppb

Limitu ta' skoperta:

Tessut (muskoli, fwied)………………………… 0.1ppb

Għasel------------------------------------------------- -0.1ppb

Eżattezza:

Tessut tal-annimali (muskoli u fwied)…………………100±20%

Għasel………………………………………..………….... 100±20%

Preċiżjoni:Is-CV tal-kit ELISA huwa inqas minn 10%.

11.Avviż

12.1 Il-valuri medji tal-valuri ta 'assorbiment miksuba għall-istandards u l-kampjuni jitnaqqsu jekk ir-reaġenti u l-kampjuni ma jkunux ġew irregolati għat-temperatura tal-kamra (20-25 ℃).

12.2 Tħallix microwells jinxef bejn il-passi biex tiġi evitata riproduċibbiltà bla suċċess u ħaddem il-pass li jmiss immedjatament wara ttektek il-holder tal-microwells.

12.3 Ħawwad kull reaġent bil-mod qabel l-użu.

12.4 Żomm il-ġilda tiegħek 'il bogħod mis-soluzzjoni ta' waqfien għax hija l-0.5MH₂SO₄soluzzjoni.

12.5 Tużax il-kits skaduti.Tiskambjax ir-reaġenti ta 'lottijiet differenti, jew inkella se twaqqa' s-sensittività.

12.6 Kundizzjoni tal-ħażna: Żomm il-kits ELISA f'2-8℃, tiffriżax.Issiġilla pjanċi tal-mikrowell tal-mistrieħ, Evita dawl tax-xemx dritt waqt l-inkubazzjonijiet kollha.Il-kisi tal-pjanċi tal-mikrotiter huwa rakkomandat.

12.7 Is-soluzzjoni tas-sottostrat għandha tiġi abbandunata jekk idawwar il-kuluri.Ir-reaġenti jistgħu jiġu ddeterjorati jekk il-valur tal-assorbiment (450/630nm) tal-istandard żero huwa inqas minn 0.5 (A450nm <0.5).

12.8 Ir-reazzjoni tal-kulur teħtieġ 15-il minuta wara ż-żieda tas-soluzzjoni tas-sottostrat;Tista 'ttawwal il-ħin ta' inkubazzjoni għal 20min jew aktar jekk il-kulur ikun ħafif wisq biex jiġi determinat., qatt ma taqbeż 25min. Għall-kuntrarju, tqassar il-ħin ta 'inkubazzjoni kif suppost.

12.9 L-aħjar temperatura ta 'reazzjoni hija 25℃.Temperatura ogħla jew aktar baxxa twassal għal bidliet fil-valuri tas-sensittività u l-assorbiment.

12.Kondizzjoni tal-ħażna u perjodu ta 'ħażna

Kondizzjoni tal-ħażna: 2-8℃.

Perjodu ta 'ħażna: 12-il xahar.