vöru

1. 1.Bakgrunnur

Nítrófúran eru tilbúin breiðvirk sýklalyf, sem eru oft notuð í dýraframleiðslu vegna framúrskarandi bakteríudrepandi og lyfjahvarfaeiginleika.Þeir höfðu einnig verið notaðir sem vaxtarhvatar í svína-, alifugla- og vatnaframleiðslu.Í langtímarannsóknum á tilraunadýrum bentu til þess að móðurlyf og umbrotsefni þeirra sýndu krabbameinsvaldandi og stökkbreytandi eiginleika.Þetta hefur leitt til þess að bannað er að nota nítrófuran til meðferðar á dýrum sem notuð eru til matvælaframleiðslu.Bannað var að nota nítrófúran lyfin furaltadón, nítrófúrantóín og nítrófúrazón í matvælaframleiðslu í dýraríkinu í ESB árið 1993 og notkun fúrazólidóns var bönnuð árið 1995.

Greining á leifum nítrófúrans lyfja þarf að byggja á greiningu vefbundinna umbrotsefna nítrófúrans móðurlyfja.Þar sem móðurlyf umbrotna mjög hratt og vefjabundin nítrófuran umbrotsefni munu haldast í langan tíma, eru þessi umbrotsefni notuð sem markmið við uppgötvun á misnotkun nítrófúrana, sem innihalda Furazolidone umbrotsefni (AOZ), Furaltadon umbrotsefni (AMOZ) ), Nitrofurantoin umbrotsefni (AHD) og Nitrofurazone umbrotsefni (SEM).

AOZ-leifar ákvarðast oftast af LC-MS eða LC-MS/MS.Ensímónæmismælingar, samanborið við litskiljunaraðferðir, sýna töluverða kosti varðandi næmi, greiningarmörk, tæknibúnað og tímaþörf.(Tímakostnaður: 45 mín)

1. 2.Prófregla

Þetta ELISA sett er hannað til að greina AOZ byggt á meginreglunni um óbeina samkeppnishæfa ensím ónæmisgreiningu.Örtítraholurnar eru húðaðar með BSA-tengdum mótefnavaka.AOZ í sýni keppir við mótefnavakann sem er húðaður á örtítraplötunni um mótefnið sem bætt er við.Eftir að ensímsamtengingu hefur verið bætt við er litningabundið hvarfefni notað og merkið er mælt með litrófsmæli.Frásogið er í öfugu hlutfalli við styrk AOZ í sýninu.

1. 3.Umsóknir

Þetta sett er hægt að nota í megindlegri og eigindlegri greiningu á AOZ leifum íanima vefjum(vöðvar, lifur osfrv.), hunang.

1. 4.Krossviðbrögð

Furazolidone umbrotsefni (AOZ)…………………………..100%

Furaltadon umbrotsefni (AMOZ)…………………………<0,1%

Nitrofurantoin umbrotsefni (AHD)…………………………<0,1%

Nitrofurazon umbrotsefni (SEM)………………………………<0,1%

Furazolidón………………………………………………..…16,3%

Furaltadon……………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………………..…<1%

1. 5.Efni sem þarf

5.1Búnaður

---- Microtiter plötu litrófsmælir (450nm/630nm)

---- Snúningsuppgufunartæki eða köfnunarefnisþurrkunartæki

---- Homogenizer / magaefni

----Histari

----Vortex hrærivél

---- Miðflótta

---- Greiningarjafnvægi (inductance: 0,01g)

----Kráðpípetta: 10ml

----Gúmmípípettupera

----Rúmmálsflaska: 100ml

----Glerflaska: 10ml

----Pólýstýren skilvindurör: 2ml, 50ml

---- Örpípettur: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul margpípettu

5.2Hvarfefni

---- Etýl asetat (AR)

----n-hexan (eða n-heptan) (AR)

----Díkalíumvetnisfosfat þríhýdrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Óblandaðri saltsýra (HCl, AR)

----- Metanól

----Natríumhýdroxíð (NaOH, AR)

---- Afjónað vatn

1. 6.Kit íhlutir

l Örtítraplata húðuð með mótefnavaka, 96 brunna

l Staðlaðar lausnir (6 flöskur, 1 ml/flaska)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Stöðluð stýring: (1ml/flaska)....….100ppb

l Samþjappað ensímsamband 1ml...…..rautt lok

l Ensím samtengd þynningarefni 10ml………..græn loki

l Undirlag A 7ml…………………………………………………..…..hvítt lok

l Undirlag B 7ml……………………………………………….…..rauð hetta

l Stöðva lausn 7ml………………………………………gult lok

l 20×þétt þvottalausn 40ml

………………………………………….……gegnsætt hetta

l 2×þétt útdráttarlausn 60ml….blátt lok

l 2-Nítróbensaldehýð 15,1mg………………hvítt lok

1. 7.Undirbúningur hvarfefna

Lausn 1: afleiða hvarfefni:

Bætið 10 ml af metanóli í flöskuna með 2-nítróbensaldehýði og leysið upp.(við styrkleikann 10mM).

Lausn 2: 0,1MK₂HPO₄lausn:

Þyngd 22,8g K₂HPO₄.3H₂O til 1L af afjónuðu vatni til að leysa upp.

Lausn 3: 1M HCl lausn

Leysið upp 8,3ml óblandaðri saltsýru með afjónuðu vatni í 100ml.

Lausn 4:1M NaOH lausn

Leysið 4g NaOH upp með 100ml afjónuðu vatni.

Lausn 5: útdráttarlausn:

Þynntu 2× óblandaða útdráttarlausn með afjónuðu vatni í rúmmálshlutfallinu 1:1.Þessa lausn er hægt að varðveita í 1 mánuð við 4 ℃, sem verður notuð til að draga sýni.

Lausn 6: þvottalausn:

Þynntu 20× óblandaða þvottalausnina með afjónuðu vatni í rúmmálshlutfallinu 1:19, sem verður notað til að þvo plöturnar.Þessa þynntu lausn er hægt að varðveita í 1 mánuð við 4 ℃.

1. 8.Dæmi um undirbúning

8.1Tilkynning og varúðarráðstafanir fyrir aðgerð:

a) Vinsamlegast notaðu stakar ábendingar í tilrauninni og breyttu oddunum þegar þú gleypir mismunandi hvarfefni.

b) Gakktu úr skugga um að öll tilraunatæki séu hrein.

c) hægt er að varðveita afleiðuhvarfefnið við 2-8 ℃ í þrjá mánuði;

d) HCl lausnina má varðveita við stofuhita í 3 mánuði;

e) NaOH lausnina er hægt að varðveita í 3 mánuði við stofuhita;

f) Geymið ómeðhöndluð sýni í frysti (-20 ℃);

g) Meðhöndluð sýni er hægt að varðveita í 24 klst við 2-8 ℃ í myrkri.

8.2 Dýravefs- og lifrarsýni:

---- Einsleitu sýnin með einsleitara;

----Þyngd 1,0±0,05g af einsleita vefjasýninu í 50ml pólýstýren skilvindurör.Bætið við 4ml afjónuðu vatni, 0,5ml 1M HCl lausn og 100ul afleitt hvarfefni (sjá lausn 1).Hristið það í 2 mín.

---- Ræktið við 37 ℃ yfir nótt (um 16 klst);

---- Bættu við 5ml 0,1MK₂HPO₄ (lausn2), 0,4ml 1M NaOH (lausn4) og 5ml etýlasetat.Hristið harkalega í 30s;

---- Miðflótta við stofuhita (20-25 ℃) í 10 mínútur, að minnsta kosti 3000g;

---- Taktu 2,5 ml af lífrænum fasa flotans í 10 ml hreint glerrör, þurrkað með 50-60 ℃ köfnunarefnisgasi eða hringuppgufunartæki;

---- Leysið þurra afganginn upp með 1ml n-hexani (eða n-heptani), hringið í 30 sekúndur, bætið við 1ml útdráttarlausn (lausn5), hringið í 1 mín., blandið alveg saman.

---- Miðflöt við stofuhita (20-25^oC) í 5 mín, að minnsta kosti 3000g;

---- Fjarlægðu lífræna fasa flotsins;taktu 50μl af undirlagsvatnsfasanum til greiningar.

8.4 Hunang

----vegið 1,0±0,05g af einsleita hunangssýninu í 50ml pólýstýren skilvindurör;

----Bætið við 4ml afjónuðu vatni, 0,5ml 1M HCl (lausn3) og 100μl afleitt hvarfefni (lausn1);hristu alveg í 2mín;

---- Ræktið við 37 ℃ yfir nótt (um 16 klst);

----Bætið við 5ml 0,1MK₂HPO₄ (lausn2), 0,4ml 1M NaOH (lausn4) og 5ml etýlasetat, hristu harkalega í 30s;

---- Miðflótta við stofuhita (20-25 ℃) í 10 mínútur, að minnsta kosti 3000g;

---- Taktu 2,5 ml af lífrænum fasa flotans í 10 ml hreint glerrör, þurrkað með 50-60 ℃ köfnunarefnisgasi eða hringuppgufunartæki;

----Leysið þurra afganginn upp með 1ml n-hexani (eða n-heptani), hringið í 30 sekúndur, bætið við 1ml útdráttarlausn (lausn5), hringið í 1 mín., blandið alveg saman.

---- Miðflótta við stofuhita (20-25^oC) í 10 mín, að minnsta kosti 3000g;

---- Fjarlægðu lífræna fasann í flotinu;taktu 50μl af undirlagsvatnsfasanum til greiningar.

1. 9.Prófunarferli

9.1Takið eftir fyrir prófun

9.1.1 Gakktu úr skugga um að öll hvarfefni og örholur séu allir við stofuhita (20-25 ℃).

9.1.2 Settu öll rest hvarfefnin aftur í 2-8 ℃ strax eftir notkun.

9.1.3 Að þvo örholurnar rétt er mikilvægt skref í prófunarferlinu;það er mikilvægur þáttur í endurgerðanleika ELISA greiningarinnar.

9.1.4 Forðist ljósið og hyljið örholurnar meðan á ræktun stendur.

9.2 Greiningarskref

9.2.1 Taktu öll hvarfefni út við stofuhita (20-25 ℃) í meira en 30 mínútur, gerðu einsleitan fyrir notkun.

9.2.2 Fáðu örholurnar sem þarf út og skilaðu afganginum strax í renniláspokann við 2-8 ℃.

9.2.3 Hita skal óblandaða þvottalausnina og óblandaða útdráttarlausnina til að vera við stofuhita fyrir notkun.

9.2.4Númer:Númeraðar allar örbrunnur og allir staðlar og sýni ættu að vera keyrð í tvíriti.Skráðu staðla og sýnishorn.

9.2.5Þynning á óblandaðri mótefnalausn: þynntu óblandaða ensímlausnina með ensímtengdu þynningarefni í rúmmálshlutfallinu 1:10 (1-föld óblandaðri ensímlausn: 10-falt ensímtengd þynningarefni).

9.2.6Bætið við staðallausn/sýni og ensímsamtengingarlausn: bætið 50 µl af staðallausn eða tilbúnu sýni í samsvarandi brunna, bætið við 50 µl ensímsamtengingarlausn.Blandið varlega með því að hrista plötuna handvirkt og ræktið í 30 mínútur við 25 ℃ með loki.

9.2.7Þvo: Fjarlægðu hlífina varlega og helltu vökvanum úr brunnunum og skolaðu örholurnar með 250µl þynntri þvottalausn (lausn6) með 10 sekúndum millibili í 4-5 skipti.Gleypið afgangsvatnið með ísogandi pappír (hægt er að fjarlægja loftbóluna sem eftir er með ónotuðum odd).

9.2.8Litun: Bætið 50 µl hvarfefnislausn A og 50 µl hvarfefnislausn B í hvern brunn.Blandið varlega saman með því að rugga plötunni handvirkt og ræktið í 15 mínútur við 25 ℃ með loki (sjá 12.8).

9.2.11Mæla: Bætið 50µl af stöðvunarlausninni í hvern brunn.Blandið varlega með því að rugga plötunni handvirkt og mæla gleypni við 450nm (Það var mælt með því að mæla með tvíbylgjulengdinni 450/630nm. Lesið niðurstöðuna innan 5 mín eftir að stöðvunarlausn hefur verið bætt við. )

10 Niðurstöður

10.1Hlutfallsgleypni

Meðalgildum gleypnigilda sem fæst fyrir staðla og sýni er deilt með gleypnigildi fyrsta staðalsins (núllstaðall) og margfaldað með 100%.Núllstaðallinn er þannig gerður jafn 100% og gleypnigildin eru gefin upp í prósentum.

=

B ——gleypnistaðall (eða sýni)

B0 ——gleypni núll staðall

10.2Standard Curve

----Til að teikna staðlaðan feril: Taktu gleypnigildi staðla sem y-ás, hálflogaritmískt af styrk AOZ staðallausnarinnar (ppb) sem x-ás.

---- AOZ styrkur hvers sýnis (ppb), sem hægt er að lesa úr kvörðunarferlinu, er margfaldaður með samsvarandi þynningarstuðli hvers sýnis sem fylgt er eftir og raunverulegur styrkur sýnis er fenginn.

Vinsamlegast athugið:

Sérstakur hugbúnaður hefur verið þróaður fyrir alla gagnaskerðingu sem hægt er að útvega sé þess óskað.

Þynningarstuðull…………………………………………..……2

10.Næmni, nákvæmni og nákvæmni

Viðkvæmni: 0,025 ppb

Greiningarmörk:

Vefur (vöðvi, lifur)…………………………0.1ppb

Hunang------------------------------------------------- -0.1ppb

Nákvæmni:

Dýravefur (vöðvar og lifur)…………………………100±20%

Hunang………………………………..……………….... 100±20%

Nákvæmni:CV ELISA settsins er minna en 10%.

11.Takið eftir

12.1 Meðalgildi gleypnigildanna sem fást fyrir staðla og sýni munu lækka ef hvarfefnin og sýnin hafa ekki verið stillt á stofuhita (20-25 ℃).

12.2 Ekki leyfa örholum að þorna á milli þrepa til að koma í veg fyrir árangurslausa endurgerð og notaðu næsta skref strax eftir að hafa bankað á örholuhaldarann.

12.3 Hristið hvert hvarfefni varlega fyrir notkun.

12.4 Haltu húðinni frá stöðvunarlausninni því hún er 0,5MH₂SO₄lausn.

12.5 Ekki nota pökkin úrelt.Ekki skipta um hvarfefni mismunandi lotum, annars mun það minnka næmni.

12.6 Geymsluskilyrði: Geymið ELISA settin við 2-8 ℃, má ekki frjósa.Innsiglið hvíldar örbrunnsplötur, Forðist beint sólarljós meðan á ræktun stendur.Mælt er með því að hylja míkrótíterplöturnar.

12.7 Yfirgefa ætti undirlagslausn ef hún tekur lit.Hvarfefnin geta versnað ef gleypnigildi (450/630nm) núllstaðalsins er minna en 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Litunarhvarfið þarf 15 mín eftir að hvarfefnislausn hefur verið bætt við;Þú getur lengt ræktunartímann í 20 mínútur eða meira ef liturinn er of ljós til að hægt sé að ákvarða hana. Aldrei fara yfir 25 mínútur. Þvert á móti skaltu stytta ræktunartímann rétt.

12.9 Ákjósanlegur hvarfhiti er 25 ℃.Hærra eða lægra hitastig mun leiða til breytinga á næmi og gleypnigildum.

12.Geymsluástand og geymslutími

Geymsluástand: 2-8 ℃.

Geymslutími: 12 mánuðir.