produk

1. 1.Agtergrond

Nitrofurane is sintetiese breëspektrum antibiotika wat gereeld in diereproduksie gebruik word vir sy uitstekende antibakteriese en farmakokinetiese eienskappe.Hulle is ook as groeibevorderaars in vark-, pluimvee- en waterproduksie gebruik.In langtermyn studies met laboratoriumdiere het aangedui dat die ouermiddels en hul metaboliete karsinogene en mutageniese eienskappe getoon het.Dit het gelei tot 'n verbod op nitrofurane vir die behandeling van diere wat vir voedselproduksie gebruik word.Die nitrofuranmiddels furaltadoon, nitrofurantoïen en nitrofurazone is in 1993 in die EU verbied om in voedseldiereproduksie te gebruik, en die gebruik van furasolidoon is in 1995 verbied.

Die ontleding van residue van nitrofuranmedisyne moet gebaseer word op die opsporing van die weefselgebonde metaboliete van die nitrofuraanmoedermedisyne.Aangesien die moedermedisyne baie vinnig gemetaboliseer word, en die weefselgebonde nitrofuraanmetaboliete vir 'n lang tyd sal behou, word hierdie metaboliete gebruik as die teiken in die opsporing van die misbruik van nitrofurane, wat Furazolidone metaboliet (AOZ), Furaltadon metaboliet (AMOZ) insluit. ), Nitrofurantoïen-metaboliet (AHD) en Nitrofurazone-metaboliet (SEM).

AOZ-reste word meestal deur LC-MS of LC-MS/MS bepaal.Ensiem-immunotoetse, in vergelyking met chromatografiese metodes, toon aansienlike voordele met betrekking tot sensitiwiteit, opsporingslimiet, tegniese toerusting en tydsvereiste.(Tydkoste: 45min)

1. 2.Toets Beginsel

Hierdie ELISA-stel is ontwerp om AOZ op te spoor gebaseer op die beginsel van indirekte-mededingende ensiem-immunotoets.Die mikrotiterputte is bedek met vang BSA-gekoppelde antigeen.AOZ in monster kompeteer met die antigeen wat op die mikrotiterplaat bedek is vir die teenliggaampie wat bygevoeg is.Na die byvoeging van ensiemkonjugaat word chromogene substraat gebruik en die sein word deur 'n spektrofotometer gemeet.Die absorpsie is omgekeerd eweredig aan die AOZ-konsentrasie in die monster.

1. 3.Aansoeke

Hierdie stel kan gebruik word in kwantitatiewe en kwalitatiewe ontleding van AOZ-residu inanima weefsels(spiere, lewer ens), heuning.

1. 4.Kruisreaksies

Furazolidon metaboliet (AOZ) …………………………..100%

Furaltadon metaboliet (AMOZ) …………………………<0.1%

Nitrofurantoïenmetaboliet (AHD)…………………………<0.1%

Nitrofurasoon metaboliet (SEM)……………………………<0.1%

Furasolidon………………………………………………..…16.3%

Furaltadon……………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoïen……………………………………………….…….…<1%

Nitrofurasoon…………………………………………………..…<1%

1. 5.Materiaal benodig

5.1Toerusting

---- Mikrotiterplaatspektrofotometer (450nm/630nm)

---- Roterende verdamper of stikstofdrooginstrumente

---- Homogeniseerder /maagder

----Shaker

----Vortex menger

----Sentrifugeer

----Analitiese balans (induktansie: 0.01g)

----Gegradeerde pipet: 10ml

----Rubber pipet gloeilamp

----Volumetriese fles: 100ml

----Glasfles: 10ml

----Polistireen sentrifugeerbuis: 2ml, 50ml

----Mikropipette: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipet

5.2Reagense

---- Etielasetaat (AR)

----n-heksaan (of n-heptaan) (AR)

----Dikaliumwaterstoffosfaattrihidraat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Gekonsentreerde soutsuur (HCl, AR)

----- Metanol

----Natriumhidroksied (NaOH, AR)

----Gedeïoniseerde water

1. 6.Kit komponente

l Mikrotiterplaat bedek met antigeen, 96 putte

l Standaardoplossings (6 bottels, 1 ml/bottel)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking standaard beheer: (1ml/bottel).......100ppb

l Gekonsentreerde ensiem-konjugaat 1ml……..rooi dop

l Ensiem gekonjugeerde verdunningsmiddels 10ml………..groen dop

l Substraat A 7ml………………………………………………..…..wit doppie

l Substraat B 7ml……………………………………….…..rooi doppie

l Stopoplossing 7ml…………………………………geel doppie

l 20×gekonsentreerde wasoplossing 40ml

………………………………………….……deursigtige pet

l 2×gekonsentreerde ekstraksieoplossing 60ml….blou doppie

l 2-Nitrobensaldehied 15.1mg………………wit dop

1. 7.Reagense Voorbereiding

Oplossing 1: afgeleide reagens:

Voeg 10 ml metanol by die bottel met 2-Nitrobensaldehied en los op.(by die konsentrasie van 10mM).

Oplossing 2: 0.1MK₂HPO₄oplossing:

Weeg 22,8g K₂HPO₄.3H₂O tot 1L gedeïoniseerde water om op te los.

Oplossing 3: 1M HCl oplossing

Los 8.3ml gekonsentreerde soutsuur op met gedeïoniseerde water tot 100ml.

Oplossing 4:1M NaOH oplossing

Los 4g NaOH op met 100ml gedeïoniseerde water.

Oplossing 5: ekstraksie oplossing:

Verdun 2×gekonsentreerde ekstraksieoplossing met gedeïoniseerde water in die volumeverhouding van 1:1.Hierdie oplossing kan vir 1 maand by 4 ℃ bewaar word, wat gebruik sal word om monsters te onttrek.

Oplossing 6:was oplossing:

Verdun die 20×gekonsentreerde wasoplossing met gedeïoniseerde water in die volumeverhouding van 1:19, wat gebruik sal word om die plate te was.Hierdie verdunde oplossing kan vir 1 maand by 4 ℃ bewaar word.

1. 8.Voorbeeld voorbereidings

8.1Kennisgewing en voorsorgmaatreëls voor operasie:

a) Gebruik asseblief eenmalige wenke in die eksperiment, en verander die wenke wanneer verskillende reagense geabsorbeer word.

b) Maak seker dat alle eksperimentele instrumente skoon is.

c) die afgeleide reagens kan vir drie maande by 2-8 ℃ bewaar word;

d) Die HCl-oplossing kan vir 3 maande by kamertemperatuur bewaar word;

e) Die NaOH-oplossing kan vir 3 maande by kamertemperatuur bewaar word;

f) Hou onbehandelde monsters in vrieskas (-20℃);

g) Behandelde monsters kan vir 24 uur by 2-8℃ in donkerte bewaar word.

8.2 Dierweefsel- en lewermonsters:

---- Homogeniseer die monsters met homogeniseerder;

----Gewig 1.0±0.05g van die gehomogeniseerde weefselmonster in 50ml polistireen sentrifugeerbuis.Voeg 4ml gedeïoniseerde water, 0.5ml 1M HCl-oplossing en 100ul afgeleide reagens by (sien oplossing 1).Skud dit vir 2min.

---- Inkubeer by 37℃ oornag (ongeveer 16h);

---- Voeg 5ml 0.1MK by₂HPO₄ (oplossing2), 0,4 ml 1M NaOH (oplossing4) en 5ml etielasetaat.Skud heftig vir 30's;

---- Sentrifugeer by kamertemperatuur (20-25 ℃) vir 10 minute, ten minste 3000g;

---- Neem 2.5ml van die supernatant organiese fase in 'n 10ml skoon glasbuis, droog met 50-60℃ stikstofgas of roterende verdamper;

---- Los die droë oorskiet op met 1ml n-heksaan (of n-heptaan), draai vir 30 sekondes, voeg 1ml ekstraksie-oplossing by (oplossing5), vortex 1min, meng heeltemal.

---- Sentrifugeer by kamertemperatuur (20-25^oC) vir 5min, ten minste 3000g;

---- Verwyder die supernatant organiese fase;neem 50μl van die substraatwaterfase vir toets.

8.4 Heuning

---- weeg 1.0±0.05g van die gehomogeniseerde heuningmonster in 'n 50ml polistireen sentrifugebuis;

----Voeg 4ml gedeïoniseerde water, 0.5ml 1M HCl (oplossing3) en 100μl afgeleide reagens (oplossing1);skud heeltemal vir 2min;

----Inkubeer by 37℃ oornag (ongeveer 16h);

----Voeg 5ml 0.1MK by₂HPO₄ (oplossing2), 0,4 ml 1M NaOH (oplossing4) en 5ml etielasetaat, skud heftig vir 30s;

----Sentrifugeer by kamertemperatuur (20-25℃) vir 10min, ten minste 3000g;

----Neem 2.5ml van die supernatant organiese fase in 'n 10ml skoon glasbuis, droog met 50-60℃ stikstofgas of roterende verdamper;

----Los die droë oorskiet op met 1ml n-heksaan (of n-heptaan), draai vir 30 sekondes, voeg 1ml ekstraksie-oplossing by (oplossing5), vortex 1min, meng heeltemal.

----Sentrifugeer by kamertemperatuur (20-25^oC) vir 10min, ten minste 3000g;

----Verwyder die supernatant organiese fase;neem 50μl van die substraatwaterfase vir toets.

1. 9.Assay proses

9.1Kennisgewing voor toets

9.1.1 Maak seker dat alle reagense en mikroputte almal by kamertemperatuur (20-25℃) is.

9.1.2 Plaas al die res reagense onmiddellik na gebruik terug na 2-8℃.

9.1.3 Om die mikroputte korrek te was is 'n belangrike stap in die proses van toetsing;dit is die noodsaaklike faktor vir die reproduceerbaarheid van die ELISA-analise.

9.1.4 Vermy die lig en bedek die mikroputte tydens inkubasie.

9.2 Toetsstappe

9.2.1 Verwyder alle reagense by kamertemperatuur (20-25℃) vir meer as 30min, homogeniseer voor gebruik.

9.2.2 Haal die nodige mikroputte uit en sit die res onmiddellik terug in die ritssluitsak by 2-8℃.

9.2.3 Die gekonsentreerde wasoplossing en gekonsentreerde ekstraksieoplossing moet voor gebruik herverhit word om by kamertemperatuur te wees.

9.2.4Nommer:Elke mikroput posisies genommer en alle standaarde en monsters moet in duplikaat uitgevoer word.Teken die standaarde en monsterposisies aan.

9.2.5Verdunning van gekonsentreerde teenliggaamoplossing: verdun die gekonsentreerde ensiemoplossing met ensiemgekonjugeerde verdunningsmiddels in die volumeverhouding van 1:10 (1 voudige gekonsentreerde ensiemoplossing: 10 voudige ensiemgekonjugeerde verdunningsmiddels).

9.2.6Voeg standaardoplossing/monster en ensiemkonjugaatoplossing by: voeg 50µl standaardoplossing of voorbereide monster by ooreenstemmende putte, voeg 50µl ensiemkonjugaatoplossing by.Meng liggies deur die plaat met die hand te skud en inkubeer vir 30min by 25℃ met deksel.

9.2.7Was: Verwyder die deksel liggies en gooi die vloeistof uit die putte en spoel die mikroputte uit met 250µl verdunde wasoplossing (oplossing6) met 'n interval van 10s vir 4-5 keer.Absorbeer die oorblywende water met absorberende papier (die res lugborrel kan met ongebruikte punt uitgeskakel word).

9.2.8Kleuring: Voeg 50µl substraatoplossing A en 50µl substraatoplossing B by elke put.Meng liggies deur die plaat met die hand te skommel en inkubeer vir 15 minute by 25℃ met deksel (sien 12.8).

9.2.11Meet: Voeg 50µl die stopoplossing by elke put.Meng liggies deur die plaat met die hand te skommel en meet die absorpsie by 450nm (Dit het voorgestel meet met die dubbele golflengte van 450/630nm. Lees die resultaat binne 5min na byvoeging van stopoplossing. )

10 Resultate

10.1Persentasie absorpsie

Die gemiddelde waardes van die absorpsiewaardes wat vir die standaarde en die monsters verkry is, word gedeel deur die absorpsiewaarde van die eerste standaard (nul standaard) en vermenigvuldig met 100%.Die nulstandaard word dus gelyk aan 100% gemaak en die absorpsiewaardes word in persentasies aangehaal.

=

B ——absorpsiestandaard (of monster)

B0 ——absorpsie nul standaard

10.2Standaardkurwe

----Om 'n standaardkromme te teken: Neem die absorpsiewaarde van standaarde as y-as, semi-logaritmies van die konsentrasie van die AOZ-standaardoplossing (ppb) as x-as.

----Die AOZ-konsentrasie van elke monster (ppb), wat vanaf die kalibrasiekurwe gelees kan word, word vermenigvuldig met die ooreenstemmende verdunningsfaktor van elke monster wat gevolg word, en die werklike konsentrasie van die monster word verkry.

Neem asseblief kennis:

Spesiale sagteware is ontwikkel vir alle datavermindering, wat op aanvraag verskaf kan word.

Verdunningsfaktor…………………………………………..……2

10.Sensitiwiteit, akkuraatheid en akkuraatheid

Sensitiwiteit: 0,025 ppb

Bespeuringslimiet:

Weefsel (spier, lewer)…………………………0.1ppb

Heuning------------------------------------------------- -0.1ppb

Akkuraatheid:

Dierlike weefsel (spiere en lewer)…………………………100±20%

Heuning………………………………………..……………… 100±20%

Presisie:CV van die ELISA-stel is minder as 10%.

11.Kennisgewing

12.1 Die gemiddelde waardes van die absorpsiewaardes verkry vir die standaarde en die monsters sal verminder word indien die reagense en monsters nie na kamertemperatuur (20-25℃) gereguleer is nie.

12.2 Moenie toelaat dat mikroputte tussen stappe droog word nie om onsuksesvolle reproduceerbaarheid te vermy en voer die volgende stap onmiddellik uit nadat die mikroputtehouer getik is.

12.3 Skud elke reagens liggies voor gebruik.

12.4 Hou jou vel weg van die stopoplossing, want dit is die 0.5MH₂SO₄oplossing.

12.5 Moenie die kits verouderd gebruik nie.Moenie die reagense van verskillende groepe omruil nie, anders sal dit die sensitiwiteit verlaag.

12.6 Bergingstoestand: Hou die ELISA-stelle by 2-8℃, moenie vries nie.Seël rus mikroput plate, Vermy reguit sonlig tydens alle inkubasies.Dit word aanbeveel om die mikrotiterplate te bedek.

12.7 Substraatoplossing moet laat vaar word as dit verkleur.Die reagense kan versleg word as die absorpsiewaarde (450/630nm) van die nulstandaard minder as 0.5 (A450nm<0.5) is.

12.8 Die kleurreaksie benodig 15 minute na die byvoeging van substraatoplossing;Jy kan die inkubasietyd tot 20min of meer verleng as die kleur te lig is om bepaal te word., moet nooit 25min oorskry nie. Inteendeel, verkort die inkubasietyd behoorlik.

12.9 Die optimale reaksietemperatuur is 25℃.Hoër of laer temperatuur sal lei tot veranderinge in sensitiwiteit en absorpsiewaardes.

12.Bergingstoestand en bergingstydperk

Bergingstoestand: 2-8 ℃.

Bergingstydperk: 12 maande.