produktu

1. 1.Pozadie

Nitrofurány sú syntetické širokospektrálne antibiotiká, ktoré sa často používajú v živočíšnej výrobe pre svoje vynikajúce antibakteriálne a farmakokinetické vlastnosti.Používali sa tiež ako stimulátory rastu pri chove ošípaných, hydiny a vodných živočíchov.Dlhodobé štúdie na laboratórnych zvieratách ukázali, že pôvodné liečivá a ich metabolity vykazovali karcinogénne a mutagénne vlastnosti.To viedlo k zákazu nitrofuránov na liečbu zvierat používaných na výrobu potravín.V roku 1993 bolo v EÚ zakázané používať nitrofuránové lieky furaltadon, nitrofurantoín a nitrofurazón a používanie furazolidónu bolo zakázané v roku 1995.

Analýza rezíduí nitrofuránových liečiv musí byť založená na detekcii tkanivovo viazaných metabolitov pôvodných nitrofuránových liečiv.Keďže materské liečivá sa veľmi rýchlo metabolizujú a metabolity nitrofuránu viazané na tkanivo sa zachovajú dlhú dobu, tieto metabolity sa používajú ako cieľ pri detekcii zneužívania nitrofuránov, medzi ktoré patrí metabolit furazolidon (AOZ), metabolit furaltadon (AMOZ ), metabolit nitrofurantoínu (AHD) a metabolit nitrofurazónu (SEM).

AOZ-zvyšky sa stanovujú najčastejšie pomocou LC-MS alebo LC-MS/MS.Enzýmové imunoanalýzy v porovnaní s chromatografickými metódami vykazujú značné výhody z hľadiska citlivosti, detekčného limitu, technického vybavenia a časovej náročnosti.(Časová cena: 45 minút)

1. 2.Princíp testu

Táto súprava ELISA je určená na detekciu AOZ na princípe nepriameho kompetitívneho enzýmového imunotestu.Mikrotitračné jamky sú potiahnuté záchytným BSA-spojeným antigénom.AOZ vo vzorke súťaží s antigénom pokrytým na mikrotitračnej platni o pridanú protilátku.Po pridaní enzýmového konjugátu sa použije chromogénny substrát a signál sa meria spektrofotometrom.Absorpcia je nepriamo úmerná koncentrácii AOZ vo vzorke.

1. 3.Aplikácie

Táto súprava môže byť použitá pri kvantitatívnej a kvalitatívnej analýze rezíduí AOZ vanima tkanivá(svaly, pečeň atď.), med.

1. 4.Krížové reakcie

Metabolit furazolidónu (AOZ)………………………………..100 %

Metabolit furaltadonu (AMOZ)………………………<0,1 %

Nitrofurantoínový metabolit (AHD)…………………………<0,1 %

Nitrofurazónový metabolit (SEM)………………………...<0,1 %

Furazolidon………………………………………….…..…16,3 %

Furaltadón………………………………………………..<1 %

Nitrofurantoín……………………………………….……..<1 %

Nitrofurazón………………………………………………..<1%

1. 5.Požadované materiály

5.1Vybavenie

---- Mikrotitračný spektrofotometer (450nm/630nm)

---- Rotačný výparník alebo nástroje na sušenie dusíka

----Homogenizátor / stomacher

----Shaker

----Vortexový mixér

----Odstredivka

---- Analytická váha (indukčnosť: 0,01 g)

---- Odmerná pipeta: 10 ml

---- Gumená pipetová žiarovka

----Odmerná banka: 100ml

---- Sklenená banka: 10ml

---- Polystyrénová centrifugačná skúmavka: 2ml, 50ml

----Mikropipety: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul multipipeta

5.2Činidlá

----Etylacetát (AR)

----n-hexán (alebo n-heptán) (AR)

----Trihydrát hydrogenfosforečnanu draselného

(K₂HPO₄0,3H₂O) (AR)

---- Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (HCl, AR)

-----Metanol

---- Hydroxid sodný (NaOH, AR)

----Deionizovaná voda

1. 6.Komponenty súpravy

l Mikrotitračná platňa potiahnutá antigénom, 96 jamiek

l Štandardné roztoky (6 fliaš, 1 ml/fľaša)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Štandardná kontrola pridávania: (1 ml/fľaša)....….100 ppb

l Koncentrovaný enzýmový konjugát 1ml.......červený uzáver

l riedidlá enzýmového konjugátu 10ml………..zelený uzáver

l Substrát A 7ml…………………………………..…..biely uzáver

l Substrát B 7ml………………………………………..…..červený uzáver

l Stop roztok 7 ml…………………………………žltý uzáver

l 20×koncentrovaný premývací roztok 40ml

…………………………………..……priehľadný uzáver

l 2×koncentrovaný extrakčný roztok 60ml….modrý uzáver

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1 mg………………biely uzáver

1. 7.Príprava činidiel

Riešenie 1: derivátové činidlo:

Pridajte 10 ml metanolu do fľaše obsahujúcej 2-nitrobenzaldehyd a rozpustite.(pri koncentrácii 10 mM).

Riešenie 2: 0,1 MK₂HPO₄Riešenie:

Hmotnosť 22,8g K₂HPO₄0,3H₂0 až 1 l deionizovanej vody na rozpustenie.

Riešenie 3: 1M roztok HCI

Rozpustite 8,3 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej s deionizovanou vodou na 100 ml.

Riešenie 4:1M roztok NaOH

Rozpustite 4 g NaOH v 100 ml deionizovanej vody.

Riešenie 5: extrakčný roztok:

2× koncentrovaný extrakčný roztok zrieďte deionizovanou vodou v objemovom pomere 1:1.Tento roztok možno uchovávať 1 mesiac pri teplote 4 °C, ktorá sa použije na extrahovanie vzoriek.

Riešenie 6: umývací roztok:

20x koncentrovaný premývací roztok zrieďte deionizovanou vodou v objemovom pomere 1:19, ktorý sa použije na umývanie platní.Tento zriedený roztok sa môže uchovávať 1 mesiac pri 4 °C.

1. 8.Vzorové prípravky

8.1Upozornenie a opatrenia pred prevádzkou:

a) V experimente použite jednorazové hroty a pri absorbovaní iného činidla hroty vymeňte.

b) Uistite sa, že všetky experimentálne prístroje sú čisté.

c) derivátové činidlo sa môže uchovávať pri 2-8 °C počas troch mesiacov;

d) Roztok HCl možno uchovávať pri teplote miestnosti 3 mesiace;

e) Roztok NaOH možno uchovávať 3 mesiace pri teplote miestnosti;

f) Uchovávajte neošetrené vzorky v mrazničke (-20 °C);

g) Ošetrené vzorky sa môžu uchovávať 24 hodín pri teplote 2-8 °C v tme.

8.2 Vzorky živočíšneho tkaniva a pečene:

---- Homogenizujte vzorky homogenizátorom;

---- Navážte 1,0 ± 0,05 g vzorky homogenizovaného tkaniva do 50 ml polystyrénovej centrifugačnej skúmavky.Pridajte 4 ml deionizovanej vody, 0,5 ml 1M roztoku HCl a 100 ul derivátového činidla (pozri roztok 1).Pretrepávajte 2 minúty.

---- Inkubujte pri 37 °C cez noc (asi 16 hodín);

---- Pridajte 5 ml 0,1 MK₂HPO₄ (Riešenie2), 0,4 ml 1M NaOH (Riešenie4) a 5 ml etylacetátu.Silne pretrepávajte 30 s;

---- Centrifugujte pri izbovej teplote (20-25 ℃) 10 minút, aspoň 3000 g;

---- Vezmite 2,5 ml supernatantu organickej fázy do 10 ml čistej sklenenej skúmavky, vysušte 50-60 °C plynným dusíkom alebo rotačným odparovačom;

---- Suchý zvyšok rozpustite v 1 ml n-hexánu (alebo n-heptánu), vortexujte 30 sekúnd, pridajte 1 ml extrakčného roztoku (Riešenie5), vortexujte 1 minútu, úplne premiešajte.

---- Centrifugujte pri izbovej teplote (20-25^oC) počas 5 minút, aspoň 3000 g;

---- Odstráňte supernatant organickú fázu;odoberte 50 μl vodnej fázy substrátu na test.

8.4 Zlato

---- navážte 1,0 ± 0,05 g homogenizovanej vzorky medu do 50 ml polystyrénovej centrifugačnej skúmavky;

---- Pridajte 4 ml deionizovanej vody, 0,5 ml 1M HCl (Riešenie3) a 100 μl derivátového činidla (Riešenie1);úplne pretrepte 2 minúty;

---- Inkubujte pri 37 °C cez noc (asi 16 hodín);

----Pridajte 5ml 0,1MK₂HPO₄ (Riešenie2), 0,4 ml 1M NaOH (Riešenie4) a 5 ml etylacetátu, prudko pretrepávajte 30 s;

----Odstreďujte pri izbovej teplote (20-25 °C) 10 minút, aspoň 3000 g;

---- Vezmite 2,5 ml supernatantu organickej fázy do 10 ml čistej sklenenej skúmavky, vysušte pomocou 50-60 °C plynného dusíka alebo rotačnej odparky;

---- Suchý zvyšok rozpustite v 1 ml n-hexánu (alebo n-heptánu), vortexujte 30 sekúnd, pridajte 1 ml extrakčného roztoku (Riešenie5), vortexujte 1 minútu, úplne premiešajte.

----Odstreďujte pri izbovej teplote (20-25^oC) počas 10 minút, aspoň 3000 g;

---- Odstráňte supernatant organickú fázu;odoberte 50 μl vodnej fázy substrátu na test.

1. 9.Proces testu

9.1Upozornenie pred testom

9.1.1 Uistite sa, že všetky reagencie a mikrojamky majú izbovú teplotu (20-25 °C).

9.1.2 Ihneď po použití vráťte všetky zvyšné činidlá na 2-8 °C.

9.1.3 Správne premytie mikrojamiek je dôležitým krokom v procese analýzy;je to životne dôležitý faktor pre reprodukovateľnosť analýzy ELISA.

9.1.4 Počas inkubácie sa vyhýbajte svetlu a zakryte mikrojamky.

9.2 Kroky testu

9.2.1 Všetky činidlá odoberte pri izbovej teplote (20-25 °C) na viac ako 30 minút, pred použitím ich zhomogenizujte.

9.2.2 Vyberte potrebné mikrojamky a zvyšok ihneď vráťte do vrecka so zipsom pri teplote 2-8 °C.

9.2.3 Koncentrovaný premývací roztok a koncentrovaný extrakčný roztok by sa mali pred použitím zohriať na izbovú teplotu.

9.2.4číslo:Očíslované polohy každej mikrojamky a všetky štandardy a vzorky by sa mali analyzovať v duplikáte.Zaznamenajte polohy štandardov a vzoriek.

9.2.5Riedenie koncentrovaného roztoku protilátky: zrieďte koncentrovaný roztok enzýmu riedidlami enzýmového konjugátu v objemovom pomere 1:10 (1 krát koncentrovaný roztok enzýmu: 10 krát riedidlá enzýmového konjugátu).

9.2.6Pridajte štandardný roztok/vzorku a roztok enzýmového konjugátu: pridajte 50 µl štandardného roztoku alebo pripravenej vzorky do zodpovedajúcich jamiek, pridajte 50 µl roztoku enzýmového konjugátu.Jemne premiešajte ručným potrasením platničky a inkubujte 30 minút pri 25 °C s krytom.

9.2.7Umyť: Jemne odstráňte kryt a vylejte kvapalinu z jamiek a opláchnite mikrojamky 250 µl zriedeného premývacieho roztoku (Riešenie6) v intervale 10 s 4-5 krát.Zvyšnú vodu absorbujte savým papierom (zvyšná vzduchová bublina sa dá odstrániť nepoužitou špičkou).

9.2.8Sfarbenie: Pridajte 50 ul substrátového roztoku A a 50 ul substrátového roztoku B do každej jamky.Jemne premiešajte ručným kývaním doštičky a inkubujte 15 minút pri 25 °C s krytom (pozri 12.8).

9.2.11Zmerajte: Do každej jamky pridajte 50 µl zastavovacieho roztoku.Jemne premiešajte ručným kývaním doštičky a zmerajte absorbanciu pri 450 nm (Odporúča sa merať s duálnou vlnovou dĺžkou 450/630 nm. Výsledok odčítajte do 5 minút po pridaní zastavovacieho roztoku.)

10 Výsledky

10.1Percentuálna absorbancia

Stredné hodnoty hodnôt absorbancie získané pre štandardy a vzorky sa vydelia hodnotou absorbancie prvého štandardu (nulový štandard) a vynásobia sa 100 %.Nulový štandard sa teda rovná 100 % a hodnoty absorbancie sa uvádzajú v percentách.

=

B ——absorbčný štandard (alebo vzorka)

B0 ——štandard nulovej absorpcie

10.2Štandardná krivka

----Nakreslenie štandardnej krivky: Zoberte hodnotu absorbancie štandardov ako os y, semilogaritmickú koncentráciu štandardného roztoku AOZ (ppb) ako os x.

---- Koncentrácia AOZ každej vzorky (ppb), ktorú možno odčítať z kalibračnej krivky, sa vynásobí zodpovedajúcim faktorom riedenia každej sledovanej vzorky a získa sa skutočná koncentrácia vzorky.

Prosím, všimnite si:

Pre všetky redukcie dát bol vyvinutý špeciálny softvér, ktorý je možné dodať na požiadanie.

Faktor riedenia………………………………………….. 2

10.Citlivosť, presnosť a precíznosť

Citlivosť: 0,025 ppb

Detekčný limit:

Tkanivo (sval, pečeň) ……………………… 0,1 ppb

Med------------------------------------------------- -0,1 ppb

Presnosť:

Živočíšne tkanivo (svaly a pečeň) ……………………… 100±20 %

Med ……………………………………………………….. 100 ± 20 %

presnosť:CV súpravy ELISA je menej ako 10 %.

11.Všimnite si

12.1 Priemerné hodnoty hodnôt absorbancie získané pre štandardy a vzorky sa znížia, ak reagencie a vzorky neboli regulované na izbovú teplotu (20-25 °C).

12.2 Nenechajte mikrojamky medzi jednotlivými krokmi vyschnúť, aby ste zabránili neúspešnej reprodukovateľnosti, a ďalší krok vykonajte ihneď po klepnutí na držiak mikrojamiek.

12.3 Pred použitím každé činidlo jemne pretrepte.

12.4 Udržujte pokožku mimo dosahu zastavovacieho roztoku, pretože je 0,5 MHz₂SO₄Riešenie.

12.5 Nepoužívajte súpravy zastarané.Nevymieňajte reagencie rôznych šarží, inak sa zníži citlivosť.

12.6 Podmienky skladovania: Súpravy ELISA uchovávajte pri teplote 2-8 °C, nezmrazujte.Utesnite doštičky s mikrojamkami, počas všetkých inkubácií sa vyhýbajte priamemu slnečnému žiareniu.Odporúča sa zakryť mikrotitračné platne.

12.7 Roztok substrátu by sa mal opustiť, ak sa sfarbí.Činidlá sa môžu znehodnotiť, ak hodnota absorbancie (450/630 nm) nulového štandardu je menšia ako 0,5 (A450 nm < 0,5).

12.8 Farbiaca reakcia potrebuje 15 minút po pridaní roztoku substrátu;Inkubačný čas môžete predĺžiť na 20 minút alebo viac, ak je farba príliš svetlá na určenie., nikdy neprekračujte 25 minút. Naopak, inkubačný čas správne skráťte.

12.9 Optimálna reakčná teplota je 25 °C.Vyššia alebo nižšia teplota povedie k zmenám hodnôt citlivosti a absorbancie.

12.Podmienky skladovania a doba skladovania

Skladovacie podmienky: 2-8 ℃.

Doba skladovania: 12 mesiacov.