מוצר

1. 1.רקע כללי

ניטרופוראנים הם אנטיביוטיקה סינתטית בעלת טווח רחב, המועסקות לעתים קרובות בייצור בעלי חיים בשל תכונותיה האנטיבקטריאליות והפרמקוקינטיות המצוינות.הם שימשו גם כמקדמי גדילה בייצור חזירים, עופות וייצור מים.במחקרים ארוכי טווח עם חיות מעבדה הצביעו על כך שתרופות האב והמטבוליטים שלהן הראו מאפיינים מסרטנים ומוטגנים.זה הוביל לאיסור על ניטרופורנים לטיפול בבעלי חיים המשמשים לייצור מזון.תרופות הניטרופורן פורלטדון, ניטרופורנטואין וניטרופורזון נאסרו לשימוש בייצור מזון לבעלי חיים באיחוד האירופי ב-1993, והשימוש בפוראזולידון נאסר ב-1995.

הניתוח של שאריות תרופות ניטרופורן צריך להתבסס על זיהוי המטבוליטים הקשורים לרקמות של תרופות האב של הניטרופורן.מאחר שתרופות האב עוברות חילוף חומרים מהיר מאוד, והמטבוליטים של הניטרופורן הקשורים לרקמות יישמרו לאורך זמן, מטבוליטים אלה משמשים כמטרה בזיהוי של שימוש לרעה בניטרופורנים, הכוללים מטבוליט Furazolidone (AOZ), מטבוליט Furaltadone (AMOZ). ), מטבוליט Nitrofurantoin (AHD) ומטבוליט Nitrofurazone (SEM).

שאריות AOZ נקבעות לרוב על ידי LC-MS או LC-MS/MS.מבחני חיסון אנזים, בהשוואה לשיטות כרומטוגרפיות, מראים יתרונות ניכרים לגבי רגישות, מגבלת זיהוי, ציוד טכני ודרישת זמן.(עלות זמן: 45 דקות)

1. 2.עקרון הבדיקה

ערכת ELISA זו נועדה לזהות AOZ בהתבסס על העיקרון של ניסוי חיסוני של אנזים תחרותי עקיף.בארות המיקרוטיטר מצופות באנטיגן מקושר ללכוד BSA.AOZ במדגם מתחרה עם האנטיגן המצופה בצלחת המיקרוטיטר על הנוגדן שנוסף.לאחר הוספת צמוד האנזים, נעשה שימוש במצע כרומוגני והאות נמדד בספקטרופוטומטר.הספיגה עומדת ביחס הפוך לריכוז AOZ בדגימה.

1. 3.יישומים

ערכה זו יכולה לשמש בניתוח כמותי ואיכותי של שאריות AOZ ברקמות אנימה(שריר, כבד וכו'), דבש.

1. 4.תגובות צולבות

מטבוליט פורזולידון (AOZ)…………………………..100%

מטבוליט פורלטדון (AMOZ)…………………………<0.1%

מטבוליט ניטרופורנטואין (AHD)…………………………<0.1%

מטבוליט ניטרופורזון (SEM)…………………………………<0.1%

Furazolidone………………………………………………………..…16.3%

Furaltadone……………………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………………..…<1%

1. 5.חומרים נדרשים

5.1ציוד

---- ספקטרופוטומטר לוחות מיקרוטיטר (450nm/630nm)

---- מכשירי אידוי סיבוביים או ייבוש חנקן

---- הומוגניזר / קיבה

---- שייקר

---- מערבל מערבולת

----סַרכֶּזֶת

---- איזון אנליטי (השראות: 0.01 גרם)

---- פיפטה מדורגת: 10 מ"ל

---- נורת פיפטה גומי

---- בקבוק נפח: 100 מ"ל

---- בקבוק זכוכית: 10 מ"ל

----שפופרת צנטריפוגה פוליסטירן: 2 מ"ל, 50 מ"ל

---- מיקרופיפטות: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2ריאגנטים

---- אתיל אצטט (AR)

----n-הקסאן (או n-הפטן) (AR)

---- דיפוטסיום מימן פוספט טריהידראט

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl, AR)

-----מתנול

---- נתרן הידרוקסיד (NaOH, AR)

----מים מזוקקים

1. 6.רכיבי ערכה

l צלחת מיקרוטיטר מצופה באנטיגן, 96 בארות

l פתרונות סטנדרטיים (6 בקבוקים, 1 מ"ל/בקבוק)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l שליטה סטנדרטית: (1 מ"ל/בקבוק)....….100ppb

l מצומד אנזים מרוכז 1 מ"ל ... .... כובע אדום

l מדללים מצומדים של אנזים 10 מ"ל………..כובע ירוק

l מצע A 7ml………..............................................…..…..כובע לבן

l מצע B 7ml………..............................................….…..כובע אדום

l תמיסת עצור 7 מ"ל………………………………… מכסה צהוב

l תמיסת כביסה מרוכזת 20×40 מ"ל

………………………………………….……כובע שקוף

l 2×תמיסת מיצוי מרוכזת 60 מ"ל...מכסה כחול

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… כובע לבן

1. 7.הכנת ריאגנטים

פִּתָרוֹן 1: מגיב נגזרת:

הוסף 10 מ"ל של מתנול לבקבוק עם 2-Nitrobenzaldehyde ולהמיס.(בריכוז של 10mM).

פִּתָרוֹן 2: 0.1MK₂HPO₄פִּתָרוֹן:

משקל 22.8 גרם K₂HPO₄.3H₂O עד 1 ליטר מים מפושטים להמסה.

פִּתָרוֹן 3: תמיסה של 1M HCl

ממיסים 8.3 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת עם מים מפושטים עד 100 מ"ל.

פתרון 4:תמיסה של 1M NaOH

ממיסים 4 גרם NaOH עם 100 מ"ל מים מפוזרים.

פתרון 5: פתרון מיצוי:

יש לדלל תמיסת מיצוי מרוכזת 2× במים מפושטים ביחס נפח של 1:1.פתרון זה יכול להישמר במשך חודש אחד בטמפרטורה של 4℃, אשר ישמש לחילוץ דגימות.

פִּתָרוֹן 6: תמיסת כביסה:

יש לדלל את תמיסת הכביסה המרוכזת של 20× במים מופחתים במנת נפח של 1:19, שישמשו לשטיפת הצלחות.ניתן לשמור תמיסה מדוללת זו למשך חודש בטמפרטורה של 4℃.

1. 8.הכנות לדוגמא

8.1הודעה ואמצעי זהירות לפני הפעולה:

א) אנא השתמש בעצות חד פעמיות בניסוי, ושנה את העצות בעת ספיגת ריאגנט שונה.

ב) ודא שכל מכשירי הניסוי נקיים.

ג) ניתן לשמר את המגיב הנגזר בטמפרטורה של 2-8 מעלות למשך שלושה חודשים;

ד) תמיסת HCl יכולה להישמר בטמפרטורת החדר למשך 3 חודשים;

ה) ניתן לשמור את תמיסת ה-NaOH למשך 3 חודשים בטמפרטורת החדר;

ו) שמור דגימות לא מטופלות בהקפאה (-20℃);

ז) ניתן לשמור דגימות מטופלות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 2-8 מעלות בחושך.

8.2 דגימות רקמה וכבד של בעלי חיים:

---- הומוגניזציה של הדגימות עם homogenizer;

---- משקל 1.0±0.05 גרם של דגימת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור צנטריפוגה פוליסטירן בנפח 50 מ"ל.הוסף 4 מ"ל מים מופחתים, 0.5 מ"ל תמיסה של 1M HCl ומגיב נגזר של 100 ul (ראה פתרון 1).לנער אותו במשך 2 דקות.

---- דגירה ב-37℃ למשך הלילה (בערך 16 שעות);

---- הוסף 5 מ"ל 0.1MK₂HPO₄ (פִּתָרוֹן2), 0.4 מ"ל 1M NaOH (פִּתָרוֹן4) ו-5 מ"ל אתיל אצטט.לנער בחוזקה במשך שנות ה-30;

---- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (20-25 ℃) למשך 10 דקות, לפחות 3000 גרם;

---- קח 2.5 מ"ל מהשלב האורגני הסופרנטנט לתוך צינור זכוכית נקי של 10 מ"ל, יבש עם גז חנקן 50-60℃ או מאייד סיבובי;

---- ממיסים את השאריות היבשות עם 1 מ"ל n-הקסאן (או n-הפטן), מערבלים במשך 30 שניות, מוסיפים 1 מ"ל תמיסת מיצוי (פִּתָרוֹן5), מערבבים 1 דקה, מערבבים לחלוטין.

---- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (20-25^oג) למשך 5 דקות, לפחות 3000 גרם;

---- הסר את השלב האורגני העל;קח 50μl של שלב המים המצע לבדיקה.

8.4 דבש

---- שקלו 1.0±0.05 גרם מדגימת הדבש ההומוגנית לתוך צינור צנטריפוגה של פוליסטירן בגודל 50 מ"ל;

---- הוסף 4 מ"ל מים מפושטים, 0.5 מ"ל 1M HCl (פִּתָרוֹן3) ו-100μl מגיב נגזרת (פִּתָרוֹן1);לנער לחלוטין במשך 2 דקות;

---- דגירה ב-37℃ למשך הלילה (בערך 16 שעות);

---- הוסף 5 מ"ל 0.1MK₂HPO₄ (פִּתָרוֹן2), 0.4 מ"ל 1M NaOH (פִּתָרוֹן4) ו-5 מ"ל אתיל אצטט, לנער בחוזקה במשך 30 שניות;

---- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (20-25 ℃) למשך 10 דקות, לפחות 3000 גרם;

---- קח 2.5 מ"ל מהשלב האורגני הסופרנטנט לתוך צינור זכוכית נקי של 10 מ"ל, יבש עם גז חנקן 50-60 ℃ או מאייד סיבובי;

---- ממיסים את השאריות היבשות עם 1 מ"ל n-הקסאן (או n-הפטן), מערבלים במשך 30 שניות, מוסיפים 1 מ"ל תמיסת מיצוי (פִּתָרוֹן5), מערבבים 1 דקה, מערבבים לחלוטין.

---- צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (20-25^oג) למשך 10 דקות, לפחות 3000 גרם;

---- הסר את השלב האורגני העל;קח 50μl של שלב המים המצע לבדיקה.

1. 9.תהליך בדיקה

9.1שים לב לפני הבדיקה

9.1.1 ודא שכל הריאגנטים והמיקרובארות נמצאים כולם בטמפרטורת החדר (20-25℃).

9.1.2 החזר את כל שאר הריאגנטים ל-2-8℃ מיד לאחר השימוש.

9.1.3 שטיפה נכונה של המיקרובארות היא שלב חשוב בתהליך הבדיקה;זהו הגורם החיוני לשחזור של ניתוח ELISA.

9.1.4 הימנע מהאור וכסה את בארות המיקרו במהלך הדגירה.

9.2 שלבי בדיקה

9.2.1 הוצא את כל הריאגנטים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך יותר מ-30 דקות, הומוג לפני השימוש.

9.2.2 הוציאו את המיקרובארות הדרושים והחזרו את השאר לתוך שקית הנעילה בטמפרטורה של 2-8℃ מיד.

9.2.3 יש לחמם מחדש את תמיסת הכביסה המרוכזת ואת תמיסת המיצוי המרוכזת כדי להיות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

9.2.4מספר:ממוספרים כל עמדות microwell וכל התקנים והדגימות צריכים להיות מופעלים בעותק.רשום את התקנים ואת עמדות הדוגמאות.

9.2.5דילול של תמיסת נוגדנים מרוכזת: מדללים את תמיסת האנזים המרוכזת במדללים מצומדים של אנזים ביחס נפח של 1:10 (פי 1 תמיסת אנזים מרוכזת: פי 10 מדללים מצומדים אנזים).

9.2.6הוסף תמיסה/דגימה סטנדרטית ותמיסת מצומדת אנזים: הוסף 50 µl של תמיסה סטנדרטית או דגימה מוכנה לבארות המתאימות, הוסף 50 µl תמיסת אנזים מצומדת.מערבבים בעדינות על ידי ניעור הצלחת ידנית ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25℃ עם מכסה.

9.2.7לִשְׁטוֹף: הסר את הכיסוי בעדינות ושפך את הנוזל מהבארות ושטוף את המיקרובארות עם תמיסת כביסה מדוללת 250 µl (פִּתָרוֹן6) במרווח של 10 שניות במשך 4-5 פעמים.ספג את שאריות המים בנייר סופג (ניתן לסלק את בועת האוויר הנותרת עם קצה לא בשימוש).

9.2.8צביעה: הוסף 50µl תמיסה מצע A ו-50ul תמיסה מצע B לכל באר.מערבבים בעדינות על ידי נדנדה ידנית של הצלחת ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25℃ עם מכסה (ראה 12.8).

9.2.11מידה: הוסף 50µl תמיסת העצירה לכל באר.מערבבים בעדינות על ידי נדנוד ידנית של הצלחת ומדוד את הספיגה ב-450 ננומטר (זה הציע למדוד עם אורך גל כפול של 450/630 ננומטר. קרא את התוצאה תוך 5 דקות לאחר הוספת תמיסת הפסקה.)

10 תוצאות

10.1אחוז ספיגה

הערכים הממוצעים של ערכי הספיגה המתקבלים עבור התקנים והדגימות מחולקים בערך הספיגה של התקן הראשון (תקן אפס) ומכפילים ב-100%.לפיכך, תקן האפס שווה ל-100% וערכי הספיגה מצוינים באחוזים.

=

B - תקן ספיגה (או מדגם)

B0 ——תקן ספיגה אפס

10.2עקומה סטנדרטית

----לצייר עקומה סטנדרטית: קח את ערך הספיגה של תקנים כציר y, חצי לוגריתמי של ריכוז התמיסה הסטנדרטית AOZ (ppb) כציר x.

---- ריכוז AOZ של כל דגימה (ppb), שניתן לקרוא מעקומת הכיול, מוכפל בגורם הדילול המתאים של כל דגימה שאחריה, ומתקבל ריכוז הדגימה בפועל.

שימו לב:

תוכנה מיוחדת פותחה עבור כל הפחתת נתונים, אשר ניתן לספק על פי בקשה.

גורם דילול…………………………………………..……2

10.רגישות, דיוק ודיוק

רְגִישׁוּת: 0.025ppb

מגבלת זיהוי:

רקמה (שריר, כבד)…………………………0.1ppb

דבש------------------------------------------------- -0.1ppb

דיוק:

רקמת בעלי חיים (שריר וכבד)…………………………100±20%

דבש……………………………………………………………… 100±20%

דיוק:קורות החיים של ערכת ELISA הוא פחות מ-10%.

11.הודעה

12.1 הערכים הממוצעים של ערכי הספיגה שהתקבלו עבור התקנים והדגימות יופחתו אם הריאגנטים והדגימות לא הווסתו לטמפרטורת החדר (20-25℃).

12.2 אל תאפשר למיקרו-בארות להתייבש בין השלבים כדי למנוע שחזור לא מוצלח והפעל את השלב הבא מיד לאחר הקשה על מחזיק המיקרו-בארות.

12.3 לנער כל מגיב בעדינות לפני השימוש.

12.4 הרחק את העור מתמיסת העצירה שכן הוא ה-0.5MH₂SO₄פִּתָרוֹן.

12.5 אל תשתמש בערכות לא מעודכנות.אל תחליף ריאגנטים של אצוות שונות, אחרת זה יפיל את הרגישות.

12.6 מצב אחסון: שמור את ערכות ה-ELISA בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, אין להקפיא.אטום צלחות microwell מנוחה, הימנע מאור שמש ישר במהלך כל הדגירות.מומלץ לכסות את לוחות המיקרוטיטר.

12.7 יש לנטוש תמיסת מצע אם הוא הופך לצבעים.הריאגנטים עלולים להידרדר אם ערך הספיגה (450/630nm) של תקן האפס נמוך מ-0.5 (A450nm<0.5).

12.8 תגובת הצביעה צריכה 15 דקות לאחר הוספת תמיסת המצע;אתה יכול להאריך את זמן הדגירה ל-20 דקות או יותר אם הצבע בהיר מכדי שניתן יהיה לקבוע., לעולם אל תעלה על 25 דקות. להיפך, קצר את זמן הדגירה כראוי.

12.9 טמפרטורת התגובה האופטימלית היא 25℃.טמפרטורה גבוהה או נמוכה יותר תוביל לשינויים של ערכי הרגישות והספיגה.

12.מצב אחסון ותקופת אחסון

מצב אחסון: 2-8 ℃.

תקופת אחסון: 12 חודשים.