Competitive Enzyme Immunoassay Kit a furazolidon metabolit (AOZ) kvantitatív elemzéséhez
- 1.Háttér
A nitrofuránok szintetikus, széles spektrumú antibiotikumok, amelyeket kiváló antibakteriális és farmakokinetikai tulajdonságaik miatt gyakran alkalmaznak az állattenyésztésben.Növekedésserkentőként is használták sertés-, baromfi- és vízi tenyésztésben.A laboratóriumi állatokkal végzett hosszú távú vizsgálatok azt mutatták, hogy a kiindulási gyógyszerek és metabolitjaik rákkeltő és mutagén tulajdonságokat mutattak.Ez a nitrofuránok betiltásához vezetett az élelmiszer-előállításra használt állatok kezelésére.A nitrofurán gyógyszerek, a furaltadon, nitrofurantoin és nitrofurazon 1993-ban betiltották az élelmiszer-állattenyésztésben való felhasználását az EU-ban, a furazolidon használatát 1995-ben.
A nitrofurán gyógyszermaradványok elemzésének a nitrofurán kiindulási gyógyszerek szövethez kötött metabolitjainak kimutatásán kell alapulnia.Mivel a kiindulási gyógyszerek nagyon gyorsan metabolizálódnak, és a szövethez kötött nitrofurán metabolitok hosszú ideig megmaradnak, ezeket a metabolitokat használják célpontként a nitrofuránokkal való visszaélés kimutatásában, beleértve a furazolidon metabolitot (AOZ), a furaltadon metabolitot (AMOZ). ), a nitrofurantoin metabolit (AHD) és a nitrofurazon metabolit (SEM).
Az AOZ-maradékokat leggyakrabban LC-MS vagy LC-MS/MS módszerrel határozzák meg.Az enzimes immunológiai vizsgálatok a kromatográfiás módszerekkel összehasonlítva jelentős előnyöket mutatnak az érzékenység, a kimutatási határ, a technikai felszerelés és az időigény tekintetében.(Időköltség: 45 perc)
- 2.Teszt elve
Ezt az ELISA készletet az AOZ kimutatására tervezték, az indirekt-kompetitív enzim-immunoassay elve alapján.A mikrotiter üregeket befogó BSA-kapcsolt antigénnel vonjuk be.A mintában lévő AOZ verseng a mikrotiterlemezre bevont antigénnel a hozzáadott antitestért.Az enzimkonjugátum hozzáadása után kromogén szubsztrátot használunk, és a jelet spektrofotométerrel mérjük.Az abszorpció fordítottan arányos a mintában lévő AOZ-koncentrációval.
- 3.Alkalmazások
Ez a készlet az AOZ-maradék mennyiségi és minőségi elemzésére használhatóanima szövetek(izom, máj stb.), méz.
- 4.Keresztreakciók
Furazolidon metabolit (AOZ)………………………..100%
Furaltadon metabolit (AMOZ)……………………<0,1%
Nitrofurantoin metabolit (AHD)……………………<0,1%
Nitrofurazon metabolit (SEM)………………………<0,1%
Furazolidon……………………………………………..…16,3%
Furaltadon………………………………………………..<1%
Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%
Nitrofurazon……………………………………………..<1%
- 5.Szükséges anyagok
5.1Felszerelések
----Mikrotiterlemezes spektrofotométer (450nm/630nm)
----Rotációs elpárologtató vagy nitrogénszárító műszerek
----Homogenizátor /gyomorcsillapító
----Rázó
----Vortex keverő
----Centrifuga
----Analitikai mérleg (induktivitás: 0,01g)
----Más pipetta: 10ml
----Gumi pipetta izzó
---- Mérőlombik: 100 ml
----Üveglombik: 10 ml
----Polisztirol centrifugacső: 2ml, 50ml
----Mikropipetták: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250 ul-pipetta
5.2Reagensek
----Etil-acetát (AR)
----n-hexán (vagy n-heptán) (AR)
----Dikálium-hidrogén-foszfát-trihidrát
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Tömény sósav (HCl, AR)
-----Metanol
---- Nátrium-hidroxid (NaOH, AR)
----Ionmentes víz
- 6.Kit komponensek
l Antigénnel bevont mikrotiter lemez, 96 mérőhely
l Standard oldatok (6 palack, 1 ml/palack)
0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Szabványos tüskeszabályozás: (1ml/palack).....100 ppb
l Tömény enzim konjugátum 1ml......piros kupak
l Enzim konjugátum hígítók 10ml………..zöld kupak
l A szubsztrát 7 ml……………………………..fehér kupak
l B szubsztrát 7 ml………………………………..piros kupak
l Stop oldat 7 ml ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l 20× tömény mosóoldat 40ml
…………………………………….……átlátszó kupak
l 2× tömény extrakciós oldat 60ml….kék kupak
l 2-nitrobenzaldehid 15,1 mg………………………………………………………………………………………………………………………
- 7.Reagensek előkészítése
Megoldás 1: származékos reagens:
Adjunk hozzá 10 ml metanolt a 2-nitrobenzaldehidet tartalmazó palackhoz, és oldjuk fel.(10 mM koncentrációban).
Megoldás 2: 0.1MK2HPO4megoldás:
Súlya 22,8 g K2HPO4.3H20–1 liter ionmentesített víz feloldásához.
Megoldás 3: 1 M HCl oldat
Oldjunk fel 8,3 ml tömény sósavat ionmentesített vízzel 100 ml-re.
4. megoldás:1 M NaOH oldat
Oldjunk fel 4 g NaOH-t 100 ml ionmentesített vízben.
5. megoldás: extrakciós oldat:
Hígítsa fel a 2x tömény extrakciós oldatot ionmentesített vízzel 1:1 térfogatarányban.Ez az oldat 1 hónapig eltartható 4 °C-on, amelyet a minták extrahálására használnak fel.
Megoldás 6: mosóoldat:
Hígítsa fel a 20-szoros tömény mosóoldatot ionmentesített vízzel 1:19 térfogatarányban, amelyet a lemezek mosására használunk.Ez a hígított oldat 4 °C-on 1 hónapig eltartható.
- 8.Minta előkészítés
8.1Figyelmeztetés és óvintézkedések használat előtt:
a) Kérjük, használjon egyszeri hegyeket a kísérletben, és változtassa meg a hegyeket, ha különböző reagenseket vesz fel.
b) Győződjön meg arról, hogy minden kísérleti műszer tiszta.
c) a származékos reagens 2-8°C-on három hónapig eltartható;
d) A HCl-oldat szobahőmérsékleten 3 hónapig eltartható;
e) A NaOH-oldat szobahőmérsékleten 3 hónapig tárolható;
f) A kezeletlen mintákat fagyasztva (-20 ℃) tárolja;
g) A kezelt minták 24 órán át 2-8 ℃-on, sötétben tárolhatók.
8.2 Állati szövet- és májminták:
----Homogenizálja a mintákat homogenizátorral;
----Tegyen 1,0±0,05 g homogenizált szövetmintát 50 ml-es polisztirol centrifugacsőbe.Adjunk hozzá 4 ml ionmentesített vizet, 0,5 ml 1 M HCl-oldatot és 100 ul származékreagenst (lásd az 1. oldatot).Rázza fel 2 percig.
---- Inkubálja 37 ℃-on egy éjszakán át (kb. 16 óra);
---- Adjon hozzá 5 ml 0,1 MK-t2HPO4 (megoldás2), 0,4 ml 1 M NaOH (megoldás4) és 5 ml etil-acetátot.Rázza hevesen 30 másodpercig;
---- Centrifugálja szobahőmérsékleten (20-25 ℃) 10 percig, legalább 3000 g;
---- Vegyen 2,5 ml felülúszó szerves fázist egy 10 ml-es tiszta üvegcsőbe, szárítsa meg 50-60 ℃-os nitrogéngázzal vagy rotációs bepárlóval;
---- Oldjuk fel a száraz maradékot 1 ml n-hexánnal (vagy n-heptánnal), keverjük 30 másodpercig vortex-el, adjunk hozzá 1 ml extrakciós oldatot (megoldás5), vortexelje 1 percig, keverje össze teljesen.
---- Centrifugálja szobahőmérsékleten (20-25oC) 5 percig, legalább 3000 g;
---- Távolítsuk el a felülúszó szerves fázist;vegyünk 50 μl szubsztrát vizes fázist a vizsgálathoz.
8.4 Méz
----mérjünk be 1,0±0,05 g homogenizált mézmintát egy 50 ml-es polisztirol centrifugacsőbe;
---- Adjunk hozzá 4 ml ionmentesített vizet, 0,5 ml 1 M HCl-t (megoldás3) és 100 μl származék reagens (megoldás1);teljesen rázza fel 2 percig;
---- Inkubálja 37 ℃-on egy éjszakán át (kb. 16 óra);
----Adjon hozzá 5 ml 0,1MK-t2HPO4 (megoldás2), 0,4 ml 1 M NaOH (megoldás4) és 5 ml etil-acetátot, hevesen rázza 30 másodpercig;
----Centrifugálja szobahőmérsékleten (20-25 ℃) 10 percig, legalább 3000 g;
----Vegyünk 2,5 ml felülúszó szerves fázist egy 10 ml-es tiszta üvegcsőbe, szárítsuk meg 50-60 ℃-os nitrogéngázzal vagy rotációs bepárlóval;
---- Oldjuk fel a száraz maradékot 1 ml n-hexánnal (vagy n-heptánnal), keverjük 30 másodpercig vortex-el, adjunk hozzá 1 ml extrakciós oldatot (megoldás5), vortexelje 1 percig, keverje össze teljesen.
---- Centrifugálja szobahőmérsékleten (20-25oC) 10 percig, legalább 3000 g;
---- Távolítsa el a felülúszó szerves fázist;vegyünk 50 μl szubsztrát vizes fázist a vizsgálathoz.
- 9.Vizsgálati folyamat
9.1Figyelmeztetés a vizsgálat előtt
9.1.1 Győződjön meg arról, hogy minden reagens és mikroüreg szobahőmérsékletű (20-25 ℃).
9.1.2 Használat után azonnal tegye vissza az összes többi reagenst 2-8 ℃-ra.
9.1.3 A mikrolyukak megfelelő mosása fontos lépés a vizsgálati folyamatban;ez az ELISA analízis reprodukálhatóságának létfontosságú tényezője.
9.1.4 Az inkubáció során kerülje a fényt, és fedje le a mikrolyukakat.
9.2 A vizsgálat lépései
9.2.1 Vegyen ki minden reagenst szobahőmérsékleten (20-25 ℃) több mint 30 percre, használat előtt homogenizálja.
9.2.2 Vegye ki a szükséges mikrolyukakat, a többit pedig azonnal tegye vissza a cipzáras zacskóba 2-8°C-on.
9.2.3 A tömény mosóoldatot és a koncentrált extrakciós oldatot használat előtt szobahőmérsékletűre kell felmelegíteni.
9.2.4Szám:Számozott minden mikrolyuk pozíciót, valamint minden standardot és mintát két példányban kell futtatni.Jegyezze fel a standardokat és a minták helyzetét.
9.2.5Tömény antitest oldat hígítása: hígítsa fel a koncentrált enzimoldatot enzimkonjugátum hígítókkal 1:10 térfogatarányban (1-szeres tömény enzimoldat: 10-szeres enzimkonjugátum hígítószer).
9.2.6Adjon hozzá standard oldatot/mintát és enzimkonjugátum oldatot: adjon hozzá 50 µl standard oldatot vagy előkészített mintát a megfelelő üregekbe, adjon hozzá 50 µl enzimkonjugátum oldatot.Óvatosan keverje össze a lemez kézi rázatásával, és inkubálja 30 percig 25 °C-on lefedve.
9.2.7Mosás: Óvatosan távolítsa el a fedelet, öntse ki a folyadékot az üregekből, majd öblítse ki a mikroüregeket 250 µl hígított mosóoldattal (megoldás6) 10 másodpercenként 4-5 alkalommal.A maradék vizet nedvszívó papírral itassuk fel (a maradék levegőbuborék a fel nem használt heggyel eltávolítható).
9.2.8Színezés: Adjon 50 µl A szubsztrát oldatot és 50 µl B szubsztrát oldatot minden mérőhelyhez.Óvatosan keverje össze a lemezt kézzel, és inkubálja 15 percig 25 °C-on, fedővel (lásd 12.8).
9.2.11Intézkedés: Adjon 50 µl leállító oldatot minden lyukba.Óvatosan keverje össze a lemezt kézzel, és mérje meg az abszorbanciát 450 nm-en (a 450/630 nm-es kettős hullámhosszú mérést javasolta. Olvassa le az eredményt 5 percen belül a stopoldat hozzáadása után.)
10 Eredmények
10.1Százalékos abszorbancia
A standardokra és a mintákra kapott abszorbanciaértékek átlagértékeit elosztjuk az első standard (nulla standard) abszorbancia értékével, és megszorozzuk 100%-kal.A nulla standard így egyenlő 100%-kal, és az abszorbancia értékeket százalékban adjuk meg.
=
B — abszorbancia standard (vagy minta)
B0 — abszorbancia nulla szabvány
10.2Szabványos görbe
----Egy standard görbe rajzolása: Vegyük a standardok abszorbancia értékét az y tengelynek, az AOZ standard oldat koncentrációjának féllogaritmikus értékét (ppb) az x tengelynek.
----Az egyes minták AOZ-koncentrációját (ppb), amely a kalibrációs görbéről leolvasható, megszorozzuk az egyes követett minták megfelelő hígítási tényezőjével, és megkapjuk a minta tényleges koncentrációját.
Kérjük, vegye figyelembe:
Minden adatcsökkentéshez speciális szoftver lett kifejlesztve, amely kérésre biztosítható.
Hígítási tényező………………………………………………..……2
10.Érzékenység, pontosság és precizitás
Érzékenység: 0,025 ppb
Észlelési határ:
Szövet (izom, máj)……………………………0,1 ppb
Édesem------------------------------------------------- -0,1 ppb
Pontosság:
Állati szövet (izom és máj)…………………100±20%
Méz………………………………………………….. 100±20%
Pontosság:Az ELISA kit CV-je kevesebb, mint 10%.
11.Értesítés
12.1 A standardokra és a mintákra kapott abszorbancia értékek átlagértékei csökkennek, ha a reagenseket és a mintákat nem szabályozták szobahőmérsékletre (20-25 ℃).
12.2 A sikertelen reprodukálhatóság elkerülése érdekében ne hagyja, hogy a mikroüregek megszáradjanak a lépések között, és a következő lépést azonnal végezze el, miután megérinti a mikroüreg-tartót.
12.3 Használat előtt finoman rázza fel az egyes reagenseket.
12.4 Tartsa távol bőrét a stop oldattól, mert ez a 0,5MH2SO4megoldás.
12.5 Ne használja az elavult készleteket.Ne cserélje ki a különböző tételek reagenseit, különben csökken az érzékenység.
12.6 Tárolási feltételek: Tartsa az ELISA készleteket 2-8 ℃ hőmérsékleten, ne fagyassza le.Zárja le a maradék mikrolyuk lemezeket. Kerülje az egyenes napfényt minden inkubáció alatt.A mikrotiterlemezek lefedése javasolt.
12.7 Az aljzatoldatot el kell hagyni, ha elszíneződik.A reagensek romlhatnak, ha a nulla standard abszorbancia értéke (450/630 nm) kisebb, mint 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 A színezési reakcióhoz 15 perc szükséges a szubsztrát oldat hozzáadása után;Meghosszabbíthatja az inkubációs időt 20 percre vagy többre, ha a szín túl világos ahhoz, hogy meghatározható legyen. Soha ne haladja meg a 25 percet. Ellenkezőleg, megfelelően rövidítse le az inkubációs időt.
12.9 Az optimális reakcióhőmérséklet 25 ℃.A magasabb vagy alacsonyabb hőmérséklet az érzékenység és az abszorbancia értékek változásához vezet.
12.Tárolási állapot és tárolási idő
Tárolási állapot: 2-8℃.
Tárolási idő: 12 hónap.
