Набор для конкурентного иммуноферментного анализа для количественного анализа метаболита фуразолидона (AOZ)
- 1.Задний план
Нитрофураны представляют собой синтетические антибиотики широкого спектра действия, которые часто используются в животноводстве из-за их превосходных антибактериальных и фармакокинетических свойств.Они также использовались в качестве стимуляторов роста в свиноводстве, птицеводстве и рыбоводстве.В долгосрочных исследованиях на лабораторных животных было показано, что исходные препараты и их метаболиты проявляли канцерогенные и мутагенные свойства.Это привело к запрету нитрофуранов для лечения животных, используемых для производства продуктов питания.Нитрофурановые препараты фуралтадон, нитрофурантоин и нитрофуразон были запрещены к использованию в животноводстве в ЕС в 1993 году, а использование фуразолидона было запрещено в 1995 году.
Анализ остатка нитрофурановых препаратов должен основываться на обнаружении связанных с тканями метаболитов исходных нитрофурановых препаратов.Поскольку исходные препараты очень быстро метаболизируются, а метаболиты нитрофурана, связанные с тканями, сохраняются в течение длительного времени, эти метаболиты используются в качестве мишеней при выявлении злоупотребления нитрофуранами, к которым относятся метаболит фуразолидона (АОЗ), метаболит фуралтадона (АМОЗ). ), метаболит нитрофурантоина (AHD) и метаболит нитрофуразона (SEM).
Остатки AOZ чаще всего определяют с помощью ЖХ-МС или ЖХ-МС/МС.Иммуноферментные анализы по сравнению с хроматографическими методами имеют значительные преимущества по чувствительности, пределу обнаружения, техническому оснащению и временным затратам.(Стоимость времени: 45 минут)
- 2.Принцип тестирования
Набор ИФА предназначен для выявления АОЗ по принципу непрямо-конкурентного иммуноферментного анализа.Лунки микротитровального аппарата покрыты захватывающим антигеном, связанным с БСА.AOZ в образце конкурирует с антигеном, нанесенным на планшет для микротитрования, за добавленное антитело.После добавления ферментного конъюгата используют хромогенный субстрат и измеряют сигнал с помощью спектрофотометра.Поглощение обратно пропорционально концентрации АОЗ в образце.
- 3.Приложения
Этот набор можно использовать для количественного и качественного анализа остатка АОЗ вткани анимы(мышцы, печень и т.д.), мед.
- 4.перекрестные реакции
Метаболит фуразолидона (АОЗ)……………………..100%
Метаболит фуралтадона (АМОЗ)……………………<0,1%
Метаболит нитрофурантоина (AHD)……………………<0,1%
Метаболит нитрофуразона (SEM)…………………………<0,1%
Фуразолидон……………………………………….…..…16,3%
Фуральтадон……………………………………………….…<1%
Нитрофурантоин……………………………………….…….…<1%
Нитрофуразон……………………………………………..…<1%
- 5.Требуемые материалы
5.1Оборудование
---- Спектрофотометр для микротитровальных планшетов (450 нм/630 нм)
----Роторный испаритель или инструменты для сушки азотом
----Гомогенизатор/желудок
---- Шейкер
----Вихревой смеситель
---- Центрифуга
---- Аналитические весы (индуктивность: 0,01 г)
---- Градуированная пипетка: 10 мл
---- Резиновая груша для пипетки
---- Объемная колба: 100 мл
---- Стеклянная колба: 10 мл
---- Полистирольная центрифужная пробирка: 2 мл, 50 мл
---- Микропипетки: 20 мкл-200 мкл, 100 мкл-1000 мкл,
250 мкл-мультипипетка
5.2Реагенты
----Этилацетат (АР)
----н-гексан (или н-гептан) (AR)
---- тригидрат гидрофосфата калия
(K2ГПО4.3ч2О) (АР)
----Концентрированная соляная кислота (HCl, AR)
-----Метанол
----Гидроксид натрия (NaOH, AR)
----Деионизированная вода
- 6.Компоненты комплекта
l Микротитровальный планшет, покрытый антигеном, 96 лунок
l Стандартные растворы (6 бутылок, 1 мл/бутылка)
0 частей на миллиард, 0,025 частей на миллиард, 0,075 частей на миллиард, 0,225 частей на миллиард, 0,675 частей на миллиард, 2,025 частей на миллиард
l Стандартный контроль с добавлением: (1 мл/бутылка)....….100ppb
l Конъюгат ферментов концентрированный 1мл……..красная крышка
l Разбавители ферментных конъюгатов 10 мл………..зеленая крышка
l Субстрат A 7мл………............……………..…..белый колпачок
л Субстрат B 7мл………............………….…..красная крышка
л Стоп-раствор 7 мл………………………………желтая крышка
л 20×концентрированный промывочный раствор 40мл
……………………………………….……прозрачная крышка
л 2×концентрированный экстракционный раствор 60 мл….синяя крышка
л 2-нитробензальдегид 15,1 мг………………белая крышка
- 7.Подготовка реагентов
Решение 1: производный реагент:
Добавьте 10 мл метанола в бутыль с 2-нитробензальдегидом и растворите.(в концентрации 10 мМ).
Решение 2: 0,1 МК2ГПО4решение:
Вес 22,8 г К2ГПО4.3ч2От 0 до 1 л деионизированной воды для растворения.
Решение 3: 1М раствор HCl
Растворите 8,3 мл концентрированной соляной кислоты. деионизированной водой до 100мл.
Решение 4:1М раствор NaOH
Растворите 4 г NaOH в 100 мл деионизированной воды.
Решение 5: экстракционный раствор:
Разбавьте 2-кратный концентрированный экстракционный раствор деионизированной водой в объемном соотношении 1:1.Этот раствор можно хранить в течение 1 месяца при температуре 4 ℃, который будет использоваться для извлечения образцов.
Решение 6: промывочный раствор:
Разбавьте 20-кратный концентрированный промывочный раствор деионизированной водой в объемном соотношении 1:19, которая будет использоваться для промывки планшетов.Этот разбавленный раствор можно хранить в течение 1 месяца при температуре 4℃.
- 8.Подготовка проб
8.1Уведомления и меры предосторожности перед эксплуатацией:
а) Пожалуйста, используйте одноразовые наконечники в эксперименте и меняйте наконечники при абсорбции другого реагента.
б) Убедитесь, что все экспериментальные инструменты чистые.
в) производный реагент может храниться при температуре 2-8°С в течение трех месяцев;
г) раствор HCl можно хранить при комнатной температуре в течение 3 месяцев;
д) раствор NaOH можно хранить в течение 3 месяцев при комнатной температуре;
f) Хранить необработанные образцы в морозильной камере (-20 ℃);
g) Обработанные образцы можно хранить в течение 24 часов при температуре 2-8 ℃ в темноте.
8.2 Образцы тканей и печени животных:
----Гомогенизируйте образцы гомогенизатором;
---- Взвесьте 1,0 ± 0,05 г гомогенизированного образца ткани в полистироловую центрифужную пробирку объемом 50 мл.Добавьте 4 мл деионизированной воды, 0,5 мл 1М раствора HCl и 100 мкл производного реагента (см. раствор 1).Встряхните его в течение 2 минут.
---- Инкубируйте при 37 ℃ в течение ночи (около 16 часов);
---- Добавить 5 мл 0,1 МК2ГПО4 (решение2), 0,4 мл 1М NaOH (решение4) и 5 мл этилацетата.Яростно трясти в течение 30 секунд;
---- Центрифуга при комнатной температуре (20-25 ℃) в течение 10 минут, не менее 3000 г;
---- Возьмите 2,5 мл надосадочной органической фазы в чистую стеклянную пробирку объемом 10 мл, высушите азотом при 50-60 ℃ или роторным испарителем;
---- Растворите сухой остаток в 1 мл н-гексана (или н-гептана), вортексируйте в течение 30 с, добавьте 1 мл экстракционного раствора (решение5), вортексируйте 1 мин, полностью перемешайте.
---- Центрифугировать при комнатной температуре (20-25oв) за 5мин не менее 3000г;
---- Удалить надосадочную органическую фазу;взять 50 мкл водной фазы субстрата для анализа.
8.4 Мед
---- взвесьте 1,0 ± 0,05 г гомогенизированного образца меда в центрифужную пробирку из полистирола объемом 50 мл;
----Добавить 4 мл деионизированной воды, 0,5 мл 1M HCl (решение3) и 100 мкл производного реагента (решение1);полностью встряхнуть в течение 2 мин;
---- Инкубируйте при 37 ℃ в течение ночи (около 16 часов);
----Добавить 5 мл 0,1 МК2ГПО4 (решение2), 0,4 мл 1М NaOH (решение4) и 5 мл этилацетата, интенсивно встряхивать в течение 30 с;
---- Центрифуга при комнатной температуре (20-25 ℃) в течение 10 минут, не менее 3000 г;
----Взять 2,5 мл надосадочной органической фазы в чистую стеклянную пробирку объемом 10 мл, высушить азотом при температуре 50-60 ℃ или роторным испарителем;
---- Растворите сухой остаток в 1 мл н-гексана (или н-гептана), вортексируйте в течение 30 с, добавьте 1 мл экстракционного раствора (решение5), вортексируйте 1 мин, полностью перемешайте.
----Центрифугировать при комнатной температуре (20-25oв) за 10 мин не менее 3000 г;
---- Удалить надосадочную органическую фазу;взять 50 мкл водной фазы субстрата для анализа.
- 9.Процесс анализа
9.1Обратите внимание перед анализом
9.1.1 Убедитесь, что все реагенты и микролунки имеют комнатную температуру (20–25 ℃).
9.1.2 Верните все остальные реагенты к температуре 2-8 ℃ сразу после использования.
9.1.3 Правильная промывка микролунок является важным этапом в процессе анализа;это жизненно важный фактор для воспроизводимости анализа ELISA.
9.1.4 Избегайте света и накрывайте микролунки во время инкубации.
9.2 Этапы анализа
9.2.1 Выдержать все реагенты при комнатной температуре (20-25°С) более 30 минут, гомогенизировать перед использованием.
9.2.2 Достаньте необходимые микролунки и немедленно положите остальные в пакет с застежкой-молнией при температуре 2-8℃.
9.2.3 Концентрированный промывной раствор и концентрированный раствор для экстракции перед использованием следует подогреть до комнатной температуры.
9.2.4Число:Каждая позиция микролунки пронумерована, а все стандарты и образцы должны быть проанализированы в двух экземплярах.Запишите положения стандартов и образцов.
9.2.5Разведение концентрированного раствора антител: разбавьте концентрированный раствор фермента разбавителями ферментных конъюгатов в объемном соотношении 1:10 (1-кратный концентрированный раствор фермента: 10-кратный разбавитель ферментных конъюгатов).
9.2.6Добавьте стандартный раствор/образец и раствор ферментного конъюгата: добавьте 50 мкл стандартного раствора или подготовленного образца в соответствующие лунки, добавьте 50 мкл раствора ферментного конъюгата.Аккуратно перемешайте, встряхивая планшет вручную, и инкубируйте в течение 30 минут при 25 ℃ под крышкой.
9.2.7Стирать: Аккуратно снимите крышку, вылейте жидкость из лунок и промойте микролунки 250 мкл разбавленного промывочного раствора (решение6) с интервалом 10 с 4-5 раз.Соберите оставшуюся воду впитывающей бумагой (остатки пузырьков воздуха можно удалить с помощью неиспользованного наконечника).
9.2.8Окраска: Добавьте 50 мкл раствора субстрата А и 50 мкл раствора субстрата В в каждую лунку.Аккуратно перемешайте, покачивая планшет вручную, и инкубируйте в течение 15 мин при 25°С под крышкой (см. 12.8).
9.2.11Мера: Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку.Аккуратно перемешайте, покачивая планшет вручную, и измерьте поглощение при 450 нм (рекомендуется измерять с двойной длиной волны 450/630 нм. Прочитайте результат в течение 5 минут после добавления стоп-раствора).
10 Результаты
10.1Процентное поглощение
Средние значения значений абсорбции, полученные для стандартов и образцов, делят на значение абсорбции первого стандарта (нулевого стандарта) и умножают на 100%.Таким образом, нулевой стандарт принимается равным 100%, а значения абсорбции приводятся в процентах.
=
B — стандарт поглощения (или образец)
B0 — нулевой стандарт поглощения
10.2Стандартная кривая
----Чтобы построить стандартную кривую: Возьмите значение абсорбции стандартов по оси ординат, полулогарифм концентрации стандартного раствора AOZ (млрд) по оси абсцисс.
---- Концентрация AOZ в каждом образце (ppb), которую можно считать по калибровочной кривой, умножается на соответствующий коэффициент разбавления каждого последующего образца, и получается фактическая концентрация образца.
Пожалуйста отметьте:
Для обработки всех данных было разработано специальное программное обеспечение, которое может быть предоставлено по запросу.
Коэффициент разбавления…………………………………………..……2
10.Чувствительность, точность и прецизионность
Чувствительность: 0,025 частей на миллиард
Предел обнаружения:
Ткань (мышцы, печень)…………………………0,1ppb
Медовый------------------------------------------------- -0,1ppb
Точность:
Ткани животных (мышцы и печень)…………………100±20%
Мед…………………………………..………….... 100±20%
Точность:CV набора ELISA составляет менее 10%.
11.Уведомление
12.1 Средние значения значений оптической плотности, полученные для стандартов и образцов, будут уменьшены, если реагенты и образцы не были отрегулированы до комнатной температуры (20-25 ℃).
12.2 Не допускайте высыхания микролунок между этапами во избежание неудачной воспроизводимости и переходите к следующему этапу сразу же после постукивания по держателю микропланшетов.
12.3 Осторожно встряхните каждый реагент перед использованием.
12.4 Держите кожу подальше от стоп-раствора, так как это 0,5 МН.2SO4решение.
12.5 Не используйте просроченные комплекты.Не меняйте реагенты разных партий, иначе чувствительность снизится.
12.6 Условия хранения: Храните наборы ELISA при температуре 2-8℃, не замораживайте.Запечатайте остальные микролуночные планшеты. Избегайте прямых солнечных лучей во время всех инкубаций.Рекомендуется накрывать планшеты для микротитрования.
12.7 От раствора субстрата следует отказаться, если он изменил цвет.Реагенты могут испортиться, если значение поглощения (450/630 нм) нулевого стандарта меньше 0,5 (A450 нм<0,5).
12.8. Для реакции окрашивания требуется 15 мин после добавления раствора субстрата;Вы можете увеличить время инкубации до 20 минут или более, если цвет слишком светлый, чтобы его можно было определить. Никогда не превышайте 25 минут. Наоборот, сократите время инкубации должным образом.
12.9 Оптимальная температура реакции составляет 25℃.Более высокая или более низкая температура приведет к изменению значений чувствительности и оптической плотности.
12.Условия хранения и срок хранения
Условия хранения: 2-8℃.
Срок хранения: 12 месяцев.
