produktas

1. 1.Fonas

Nitrofuranai yra sintetiniai plataus veikimo spektro antibiotikai, kurie dėl puikių antibakterinių ir farmakokinetinių savybių dažnai naudojami gyvulininkystėje.Jie taip pat buvo naudojami kaip augimo stimuliatoriai kiaulių, paukštienos ir vandens auginimui.Ilgalaikiai tyrimai su laboratoriniais gyvūnais parodė, kad pirminiai vaistai ir jų metabolitai pasižymi kancerogeninėmis ir mutageninėmis savybėmis.Dėl to buvo uždrausta naudoti nitrofuranus maisto gamybai naudojamų gyvūnų gydymui.1993 metais ES uždrausta naudoti nitrofurano preparatus furaltadoną, nitrofurantoiną ir nitrofurazoną maistinių gyvūnų gamyboje, o furazolidoną – 1995 metais.

Nitrofurano vaistų likučių analizė turi būti pagrįsta pirminių nitrofurano vaistų metabolitų, susietų su audiniu, aptikimu.Kadangi pirminiai vaistai labai greitai metabolizuojami, o su audiniu susieti nitrofurano metabolitai išliks ilgą laiką, šie metabolitai naudojami kaip taikinys nustatant piktnaudžiavimą nitrofuranais, įskaitant furazolidono metabolitą (AOZ), furaltadono metabolitą (AMOZ). ), nitrofurantoino metabolitas (AHD) ir nitrofurazono metabolitas (SEM).

AOZ likučiai dažniausiai nustatomi LC-MS arba LC-MS/MS.Fermentiniai imunologiniai tyrimai, palyginti su chromatografiniais metodais, turi didelių pranašumų jautrumo, aptikimo ribos, techninės įrangos ir laiko poreikio atžvilgiu.(Laiko kaina: 45 min.)

1. 2.Testo principas

Šis ELISA rinkinys skirtas AOZ aptikti remiantis netiesioginio konkurencinio fermento imunologinio tyrimo principu.Mikrotitro šulinėliai yra padengti su BSA susietu antigenu.AOZ mėginyje konkuruoja su antigenu, padengtu ant mikrotitravimo plokštelės dėl pridėto antikūno.Pridėjus fermento konjugato, naudojamas chromogeninis substratas, o signalas matuojamas spektrofotometru.Absorbcija yra atvirkščiai proporcinga AOZ koncentracijai mėginyje.

1. 3.Programos

Šis rinkinys gali būti naudojamas kiekybinei ir kokybinei AOZ likučių analizeianima audiniai(raumenys, kepenys ir kt.), medus.

1. 4.Kryžminės reakcijos

Furazolidono metabolitas (AOZ)……………………..100 proc.

Furaltadono metabolitas (AMOZ)……………………<0,1 %

Nitrofurantoino metabolitas (AHD)……………………<0,1 %

Nitrofurazono metabolitas (SEM)………………………<0,1 %

Furazolidonas…………………………………………..…16,3%

Furaltadonas…………………………………………….…<1 %

Nitrofurantoinas…………………………………….…….…<1 %

Nitrofurazonas……………………………………………..<1 %

1. 5.Reikalingos medžiagos

5.1Įranga

---- Mikrotitravimo plokštelės spektrofotometras (450 nm / 630 nm)

---- Rotorinis garintuvas arba azoto džiovinimo instrumentai

---- Homogenizatorius / skrandis

---- Purtyklė

----Vortex maišytuvas

----Centrifuga

---- Analitinės svarstyklės (induktyvumas: 0,01 g)

---- Pipetė su gradacija: 10 ml

---- Guminės pipetės lemputė

----Mūrinė kolba: 100ml

----Stiklinė kolba: 10ml

---- Polistireno centrifugos vamzdelis: 2ml, 50ml

---- Mikropipetės: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250 ul-multipipetė

5.2Reagentai

----Etilo acetatas (AR)

----n-heksanas (arba n-heptanas) (AR)

----Dikalio vandenilio fosfato trihidratas

(K₂HPO₄.3H₂IRKLAS)

---- Koncentruota druskos rūgštis (HCl, AR)

----- Metanolis

---- Natrio hidroksidas (NaOH, AR)

---- Dejonizuotas vanduo

1. 6.Komplekto komponentai

l Mikrotitravimo plokštelė, padengta antigenu, 96 šulinėliai

l Standartiniai tirpalai (6 buteliai, 1 ml / butelis)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Standartinė spygliuočių kontrolė: (1ml/buteliukas)....100 ppb

l Koncentruotas fermentų konjugatas 1ml.....raudonas dangtelis

l Fermentų konjugato skiedikliai 10ml………..žalia dangtelis

l Substratas A 7 ml……………………………..baltas dangtelis

l Substratas B 7ml……………………………..raudonas dangtelis

l Stop tirpalas 7ml……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

l 20×koncentruotas plovimo tirpalas 40ml

…………………………………….……permatomas dangtelis

l 2×koncentruotas ekstrahavimo tirpalas 60ml….mėlynas dangtelis

l 2-nitrobenzaldehidas 15,1 mg……………………………………………………………………………

1. 7.Reagentų paruošimas

Sprendimas 1: išvestinis reagentas:

Į buteliuką su 2-nitrobenzaldehidu įpilkite 10 ml metanolio ir ištirpinkite.(esant 10 mM koncentracijai).

Sprendimas 2: 0,1 MK₂HPO₄sprendimas:

Sveria 22,8g K₂HPO₄.3H₂O iki 1 l dejonizuoto vandens, kad ištirptų.

Sprendimas 3: 1M HCl tirpalas

Ištirpinkite 8,3 ml koncentruotos druskos rūgšties su dejonizuotu vandeniu iki 100 ml.

4 sprendimas:1M NaOH tirpalas

4 g NaOH ištirpinkite 100 ml dejonizuoto vandens.

5 sprendimas: ekstrahavimo tirpalas:

Atskieskite 2x koncentruotą ekstrahavimo tirpalą dejonizuotu vandeniu tūrio santykiu 1:1.Šį tirpalą galima laikyti 1 mėnesį 4 ℃ temperatūroje, kuris bus naudojamas mėginiams ekstrahuoti.

Sprendimas 6: plovimo tirpalas:

Atskieskite 20 × koncentruotą plovimo tirpalą dejonizuotu vandeniu tūrio santykiu 1:19, kuris bus naudojamas plokštelėms plauti.Šį atskiestą tirpalą galima laikyti 1 mėnesį 4 ℃ temperatūroje.

1. 8.Mėginių paruošimas

8.1Pastaba ir atsargumo priemonės prieš pradedant darbą:

a) Eksperimente naudokite vienkartinius antgalius ir pakeiskite antgalius, kai sugeriamas skirtingas reagentas.

b) Įsitikinkite, kad visi eksperimentiniai instrumentai yra švarūs.

c) išvestinį reagentą galima laikyti 2–8 ℃ temperatūroje tris mėnesius;

d) HCl tirpalą galima laikyti kambario temperatūroje 3 mėnesius;

e) NaOH tirpalą galima laikyti 3 mėnesius kambario temperatūroje;

f) Neapdorotus mėginius laikykite šaldytuve (-20 ℃);

g) Apdorotus mėginius galima laikyti 24 valandas 2–8 ℃ temperatūroje tamsoje.

8.2 Gyvūnų audinių ir kepenų mėginiai:

----Homogenizuoti mėginius homogenizatoriumi;

---- 1,0±0,05 g homogenizuoto audinio mėginio įdėkite į 50 ml polistireno centrifugos mėgintuvėlį.Įpilkite 4 ml dejonizuoto vandens, 0,5 ml 1 M HCl tirpalo ir 100 ul darinio reagento (žr. 1 tirpalą).Suplakite 2 min.

---- Inkubuokite 37 ℃ per naktį (apie 16 val.);

---- Įpilkite 5 ml 0,1MK₂HPO₄ (sprendimas2), 0,4 ml 1 M NaOH (sprendimas4) ir 5 ml etilo acetato.Stipriai purtykite 30s;

---- Centrifuguokite kambario temperatūroje (20-25 ℃) 10 min, ne mažiau 3000 g;

---- Į 10 ml švarų stiklinį mėgintuvėlį paimkite 2,5 ml supernatanto organinės fazės, išdžiovinkite 50–60 ℃ azoto dujomis arba rotaciniu garintuvu;

---- Sausus likučius ištirpinkite 1 ml n-heksano (arba n-heptano), 30 s maišydami sumaišykite, įpilkite 1 ml ekstrahavimo tirpalo (sprendimas5), sumaišykite 1 min., iki galo išmaišykite.

---- Centrifuguokite kambario temperatūroje (20-25^oC) 5min, mažiausiai 3000g;

---- Pašalinkite supernatantą organinę fazę;paimkite 50 μl substrato vandens fazės tyrimui.

8.4 Medus

---- pasverkite 1,0±0,05 g homogenizuoto medaus mėginio į 50 ml polistireno centrifugos mėgintuvėlį;

----Įpilkite 4 ml dejonizuoto vandens, 0,5 ml 1 M HCl (sprendimas3) ir 100 μl darinio reagento (sprendimas1);pilnai suplakti 2 min;

---- Inkubuokite 37 ℃ per naktį (apie 16 val.);

----Įpilkite 5 ml 0,1MK₂HPO₄ (sprendimas2), 0,4 ml 1 M NaOH (sprendimas4) ir 5 ml etilo acetato, stipriai kratykite 30 s;

---- Centrifuguokite kambario temperatūroje (20-25 ℃) 10 min, ne mažiau 3000 g;

---- Supilkite 2,5 ml organinės fazės supernatanto į 10 ml švarų stiklinį mėgintuvėlį, išdžiovinkite 50–60 ℃ azoto dujomis arba rotaciniu garintuvu;

---- Sausus likučius ištirpinkite 1 ml n-heksano (arba n-heptano), 30 s maišydami sumaišykite, įpilkite 1 ml ekstrahavimo tirpalo (sprendimas5), sumaišykite 1 min., iki galo išmaišykite.

---- Centrifuguokite kambario temperatūroje (20-25^oC) 10min, ne mažiau 3000g;

----Pašalinkite supernatantą organinę fazę;paimkite 50 μl substrato vandens fazės tyrimui.

1. 9.Tyrimo procesas

9.1Atkreipkite dėmesį prieš tyrimą

9.1.1 Įsitikinkite, kad visi reagentai ir mikrošulinėliai yra kambario temperatūros (20–25 ℃).

9.1.2 Iš karto po naudojimo grąžinkite visus likusius reagentus į 2–8 ℃ temperatūrą.

9.1.3 Tinkamas mikrošulinėlių išplovimas yra svarbus tyrimo proceso etapas;tai gyvybiškai svarbus ELISA analizės atkuriamumo veiksnys.

9.1.4 Venkite šviesos ir uždenkite mikrošulinėlius inkubacijos metu.

9.2 Tyrimo etapai

9.2.1 Išimkite visus reagentus kambario temperatūroje (20-25 ℃) ilgiau nei 30 min., prieš naudodami homogenizuokite.

9.2.2 Išimkite reikiamus šulinėlius, o likusius nedelsdami grąžinkite į užtrauktuku užsegamą maišelį 2–8 ℃ temperatūroje.

9.2.3 Prieš naudojant koncentruotą plovimo tirpalą ir koncentruotą ekstrahavimo tirpalą reikia pašildyti iki kambario temperatūros.

9.2.4Numeris:Kiekviena mikrošulinėlio padėtis sunumeruota ir visi standartai bei mėginiai turi būti paleisti dviem egzemplioriais.Užrašykite standartų ir pavyzdžių pozicijas.

9.2.5Koncentruoto antikūnų tirpalo skiedimas: praskieskite koncentruotą fermento tirpalą fermentų konjugato skiedikliais tūrio santykiu 1:10 (1 karto koncentruotas fermento tirpalas: 10 kartų fermentų konjugato skiedikliai).

9.2.6Įpilkite standartinio tirpalo / mėginio ir fermento konjugato tirpalo: į atitinkamas duobutes įpilkite 50 µl standartinio tirpalo arba paruošto mėginio, įpilkite 50 µl fermento konjugato tirpalo.Švelniai sumaišykite, purtydami lėkštę rankiniu būdu, ir inkubuokite 30 minučių 25 ℃ temperatūroje uždengę.

9.2.7Nuplaukite: Švelniai nuimkite dangtelį ir išpilkite skystį iš šulinėlių ir išskalaukite mikrošulinėlius 250 µl praskiesto plovimo tirpalo (sprendimas6) 10s intervalu 4-5 kartus.Vandens likučius sugerkite sugeriančiu popieriumi (likusį oro burbuliuką galite pašalinti nenaudojamu antgaliu).

9.2.8Spalvinimas: Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl substrato tirpalo A ir 50 ul substrato tirpalo B.Švelniai sumaišykite lėkštę rankiniu būdu ir inkubuokite 15 minučių 25 ℃ temperatūroje su dangteliu (žr. 12.8).

9.2.11Išmatuoti: Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 50 µl stabdymo tirpalo.Švelniai maišykite, siūbuodami plokštelę rankiniu būdu, ir išmatuokite absorbciją esant 450 nm (siūloma matuoti naudojant dvigubą 450/630 nm bangos ilgį. Nuskaitykite rezultatą per 5 minutes po stabdymo tirpalo pridėjimo.)

10 Rezultatai

10.1Procentinė absorbcija

Gautos etalonų ir mėginių absorbcijos verčių vidutinės vertės dalijamos iš pirmojo etalono (nulinio standarto) absorbcijos vertės ir padauginamos iš 100%.Taigi nulinis standartas yra lygus 100%, o absorbcijos vertės nurodomos procentais.

=

B — absorbcijos standartas (arba mėginys)

B0 — — absorbcijos nulinis standartas

10.2Standartinė kreivė

----Norėdami nubrėžti standartinę kreivę: paimkite etalonų absorbcijos vertę kaip y ašį, o pusiau logaritminę AOZ etaloninio tirpalo koncentraciją (ppb) kaip x ašį.

----Kiekvieno mėginio AOZ koncentracija (ppb), kurią galima nuskaityti iš kalibravimo kreivės, padauginama iš atitinkamo kiekvieno mėginio praskiedimo koeficiento ir gaunama tikroji mėginio koncentracija.

Atkreipkite dėmesį:

Visiems duomenų mažinimui buvo sukurta speciali programinė įranga, kurią galima pateikti paprašius.

Skiedimo koeficientas……………………………………………………2

10.Jautrumas, tikslumas ir tikslumas

Jautrumas: 0,025 ppb

Aptikimo riba:

Audinys (raumenys, kepenys)………………………… 0,1 ppb

Medus------------------------------------------------- -0,1 ppb

Tikslumas:

Gyvūninis audinys (raumenys ir kepenys)…………………100±20 proc.

Medus………………………………………………….. 100±20%

Tikslumas:ELISA rinkinio CV yra mažesnis nei 10%.

11.Pastebėti

12.1. Jei reagentai ir mėginiai nebuvo sureguliuoti iki kambario temperatūros (20-25 ℃), vidutinės absorbcijos verčių vertės, gautos standartams ir mėginiams, bus sumažintos.

12.2 Neleiskite mikrošulinėliams išdžiūti tarp etapų, kad išvengtumėte nesėkmingo atkuriamumo, ir atlikite kitą veiksmą iš karto bakstelėję mikrošulinėlių laikiklį.

12.3 Prieš naudodami kiekvieną reagentą švelniai suplakite.

12.4 Saugokite odą nuo stabdymo tirpalo, nes jis yra 0,5MH₂SO₄sprendimas.

12.5 Nenaudokite pasenusių rinkinių.Nekeiskite skirtingų partijų reagentų, kitaip sumažės jautrumas.

12.6 Laikymo sąlygos: ELISA rinkinius laikykite 2–8 ℃ temperatūroje, neužšaldykite.Uždarykite likusias mikrošulinėlių plokšteles. Visų inkubacijų metu venkite tiesioginių saulės spindulių.Mikrotitravimo plokšteles rekomenduojama uždengti.

12.7 Pagrindo tirpalo reikia atsisakyti, jei jis nusidažo.Reagentai gali būti sugadinti, jei nulinio standarto absorbcijos vertė (450/630 nm) yra mažesnė nei 0,5 (A450 nm < 0,5).

12.8 Įpylus substrato tirpalo, dažymo reakcijai reikia 15 min.;Jei spalva per šviesi, kad būtų galima nustatyti, inkubavimo laiką galite pailginti iki 20 min., niekada neviršykite 25 min. Priešingai, tinkamai sutrumpinkite inkubacijos laiką.

12.9 Optimali reakcijos temperatūra yra 25 ℃.Aukštesnė ar žemesnė temperatūra lems jautrumo ir absorbcijos verčių pokyčius.

12.Laikymo sąlygos ir laikymo laikas

Laikymo sąlygos: 2-8 ℃.

Laikymo laikotarpis: 12 mėnesių.