Product

1. 1.Achtergrond

Nitrofuranen zijn synthetische breedspectrumantibiotica, die vanwege hun uitstekende antibacteriële en farmacokinetische eigenschappen vaak in de dierlijke productie worden gebruikt.Ze werden ook gebruikt als groeibevorderaars bij varkens-, pluimvee- en aquatische productie.In langetermijnstudies met proefdieren bleek dat de moedergeneesmiddelen en hun metabolieten kankerverwekkende en mutagene eigenschappen vertoonden.Dit heeft geleid tot een verbod op nitrofuranen voor de behandeling van dieren die worden gebruikt voor voedselproductie.De nitrofurangeneesmiddelen furaltadon, nitrofurantoïne en nitrofurazon werden in 1993 in de EU verboden voor gebruik in de dierhouderij en in 1995 werd het gebruik van furazolidon verboden.

De analyse van residuen van nitrofurangeneesmiddelen moet gebaseerd zijn op de detectie van de weefselgebonden metabolieten van de nitrofuran-oudergeneesmiddelen.Aangezien de oorspronkelijke geneesmiddelen zeer snel worden gemetaboliseerd en de weefselgebonden nitrofuranmetabolieten lange tijd behouden blijven, worden deze metabolieten gebruikt als het doelwit bij het opsporen van misbruik van nitrofuranen, waaronder furazolidonmetaboliet (AOZ), furaltadonmetaboliet (AMOZ ), Nitrofurantoïnemetaboliet (AHD) en Nitrofurazonmetaboliet (SEM).

AOZ-residuen worden meestal bepaald met LC-MS of LC-MS/MS.Enzym-immunoassays vertonen, vergeleken met chromatografische methoden, aanzienlijke voordelen wat betreft gevoeligheid, detectielimiet, technische uitrusting en benodigde tijd.(Tijdskosten: 45min)

1. 2.Test Principe

Deze ELISA-kit is ontworpen om AOZ te detecteren op basis van het principe van indirect-competitieve enzymimmunoassay.De microtiterputjes zijn bekleed met invang BSA-gekoppeld antigeen.AOZ in het monster concurreert met het op de microtiterplaat gecoate antigeen om het toegevoegde antilichaam.Na toevoeging van enzymconjugaat wordt chromogeen substraat gebruikt en wordt het signaal gemeten met een spectrofotometer.De absorptie is omgekeerd evenredig met de AOZ-concentratie in het monster.

1. 3.toepassingen

Deze kit kan worden gebruikt bij kwantitatieve en kwalitatieve analyse van AOZ-residuen indierlijke weefsels(spier, lever enz.), schat.

1. 4.Kruisreacties

Furazolidonmetaboliet (AOZ)……………………..100%

Furaltadonmetaboliet (AMOZ)……………………<0,1%

Nitrofurantoïnemetaboliet (AHD)……………………<0,1%

Nitrofurazon-metaboliet (SEM)………………......<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…16,3%

Furaltadon………………………………………….…<1%

Nitrofurantoïne…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon…………………………………………..…<1%

1. 5.Benodigde materialen

5.1Uitrustingen

---- Microtiter plaat spectrofotometer (450nm/630nm)

---- Instrumenten voor het drogen van roterende verdampers of stikstof

---- Homogenisator /maag

----Shaker

----Vortex mixer

----Centrifugeer

---- Analytische balans (inductie: 0,01 g)

----Gegradueerde pipet: 10ml

----Rubberen pipetballon

---- Maatkolf: 100 ml

---- Glazen kolf: 10 ml

----Polystyreen centrifugebuis: 2 ml, 50 ml

---- Micropipetten: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipet

5.2Reagentia

----Ethylacetaat (AR)

----n-hexaan (of n-heptaan) (AR)

---- Dikaliumwaterstoffosfaattrihydraat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Geconcentreerd zoutzuur (HCl, AR)

-----Methanol

---- Natriumhydroxide (NaOH, AR)

----Gedeïoniseerd water

1. 6.Kit-componenten

l Microtiterplaat gecoat met antigeen, 96 putjes

l Standaardoplossingen (6 flessen, 1 ml/fles)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Spiking standaard controle: (1ml/fles)....….100ppb

l Geconcentreerd enzymconjugaat 1ml...…..rode dop

l Enzymconjugaat verdunningsmiddelen 10ml…………..groene dop

l Substraat A 7ml…………....…..…..witte dop

l Substraat B 7ml…………........….…..rode dop

l Stopoplossing 7ml…………………………gele dop

l 20×geconcentreerde wasoplossing 40ml

………………………………….……transparante dop

l 2×geconcentreerde extractie-oplossing 60ml….blauwe dop

l 2-Nitrobenzaldehyde 15,1 mg………………witte dop

1. 7.Bereiding van reagentia

Oplossing 1: afgeleid reagens:

Voeg 10 ml methanol toe aan de fles met 2-nitrobenzaldehyde en los op.(bij een concentratie van 10 mM).

Oplossing 2: 0,1MK₂HPO₄oplossing:

Weeg 22,8 g K₂HPO₄.3H₂O tot 1L gedeïoniseerd water om op te lossen.

Oplossing 3: 1M HCl-oplossing

Los 8,3 ml geconcentreerd zoutzuur op met gedemineraliseerd water tot 100 ml.

Oplossing 4:1M NaOH-oplossing

Los 4 g NaOH op met 100 ml gedeïoniseerd water.

Oplossing 5: extractie oplossing:

Verdun 2×geconcentreerde extractie-oplossing met gedeïoniseerd water in de volumeverhouding van 1:1.Deze oplossing kan 1 maand worden bewaard bij 4 ℃, die zal worden gebruikt om monsters te extraheren.

Oplossing 6: wasoplossing:

Verdun de 20 × geconcentreerde wasoplossing met gedeïoniseerd water in de volumeverhouding van 1:19, die zal worden gebruikt om de platen te wassen.Deze verdunde oplossing is 1 maand houdbaar bij 4℃.

1. 8.Voorbereidingen voor monsters

8.1Kennisgeving en voorzorgsmaatregelen vóór gebruik:

a) Gebruik eenmalige tips in het experiment en verander de tips wanneer u een ander reagens absorbeert.

b) Zorg ervoor dat alle experimentele instrumenten schoon zijn.

c) het afgeleide reagens kan drie maanden bij 2-8 ℃ worden bewaard;

d) De HCl-oplossing kan 3 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard;

e) De NaOH-oplossing is 3 maanden houdbaar bij kamertemperatuur;

f) Bewaar onbehandelde monsters in de vriezer (-20 ℃);

g) Behandelde monsters kunnen 24 uur bij 2-8 ℃ in het donker worden bewaard.

8.2 Dierlijke weefsel- en levermonsters:

----Homogeniseer de monsters met homogenisator;

---- Weeg 1,0 ± 0,05 g van het gehomogeniseerde weefselmonster in een polystyreen centrifugebuis van 50 ml.Voeg 4 ml gedeïoniseerd water, 0,5 ml 1M HCl-oplossing en 100 µl afgeleid reagens toe (zie oplossing 1).Schud het gedurende 2 minuten.

---- Incubeer 's nachts bij 37 ℃ (ongeveer 16 uur);

---- Voeg 5ml 0.1MK toe₂HPO₄ (oplossing2), 0,4 ml 1M NaOH (oplossing4) en 5 ml ethylacetaat.Schud hevig gedurende 30 seconden;

---- Centrifugeer bij kamertemperatuur (20-25 ℃) gedurende 10 minuten, minimaal 3000 g;

---- Neem 2,5 ml van de supernatant organische fase in een schone glazen buis van 10 ml, droog met 50-60 ℃ stikstofgas of roterende verdamper;

---- Los de droge rest op met 1 ml n-hexaan (of n-heptaan), vortex gedurende 30 seconden, voeg 1 ml extractie-oplossing toe (oplossing5), vortex 1min, meng volledig.

---- Centrifugeer bij kamertemperatuur (20-25^oC) gedurende 5 min, minimaal 3000 g;

---- Verwijder de bovendrijvende organische fase;neem 50 μl van de substraatwaterfase voor analyse.

8.4 Honing

---- weeg 1,0 ± 0,05 g van het gehomogeniseerde honingmonster in een polystyreen centrifugebuis van 50 ml;

---- Voeg 4 ml gedeïoniseerd water toe, 0,5 ml 1M HCl (oplossing3) en 100μl afgeleid reagens (oplossing1);schud volledig gedurende 2 minuten;

----Incubeer 's nachts bij 37 ℃ (ongeveer 16 uur);

----Voeg 5ml 0.1MK toe₂HPO₄ (oplossing2), 0,4 ml 1M NaOH (oplossing4) en 5 ml ethylacetaat, krachtig schudden gedurende 30 seconden;

---- Centrifugeer bij kamertemperatuur (20-25 ℃) gedurende 10 minuten, minimaal 3000 g;

---- Neem 2,5 ml van de supernatant organische fase in een schone glazen buis van 10 ml, droog met 50-60 ℃ stikstofgas of roterende verdamper;

---- Los de droge rest op met 1 ml n-hexaan (of n-heptaan), vortex gedurende 30 seconden, voeg 1 ml extractie-oplossing toe (oplossing5), vortex 1min, meng volledig.

---- Centrifugeer bij kamertemperatuur (20-25^oC) gedurende 10 min, minimaal 3000 g;

----Verwijder de bovendrijvende organische fase;neem 50 μl van de substraatwaterfase voor analyse.

1. 9.Assay-proces

9.1Let op vóór de test

9.1.1 Zorg ervoor dat alle reagentia en microwells allemaal op kamertemperatuur zijn (20-25℃).

9.1.2 Breng alle restreagentia onmiddellijk na gebruik terug naar 2-8 ℃.

9.1.3 Het correct wassen van de microwells is een belangrijke stap in het assayproces;het is de vitale factor voor de reproduceerbaarheid van de ELISA-analyse.

9.1.4 Vermijd het licht en bedek de microwells tijdens de incubatie.

9.2 Teststappen

9.2.1 Neem alle reagentia uit bij kamertemperatuur (20-25 ℃) gedurende meer dan 30 minuten, homogeniseer voor gebruik.

9.2.2 Haal de benodigde microwells eruit en doe de rest onmiddellijk terug in de zak met ritssluiting bij 2-8 ℃.

9.2.3 De geconcentreerde wasoplossing en geconcentreerde extractieoplossing moeten vóór gebruik opnieuw worden opgewarmd tot kamertemperatuur.

9.2.4Nummer:Elke positie van de microwell moet worden genummerd en alle standaarden en monsters moeten in tweevoud worden uitgevoerd.Noteer de normen en monsterposities.

9.2.5Verdunning van geconcentreerde antilichaamoplossing: verdun de geconcentreerde enzymoplossing met enzymconjugaatverdunningsmiddelen in de volumeverhouding van 1:10 (1 maal geconcentreerde enzymoplossing: 10 maal enzymconjugaatverdunningsmiddelen).

9.2.6Voeg standaardoplossing / monster en enzymconjugaatoplossing toe: voeg 50 µl standaardoplossing of geprepareerd monster toe aan overeenkomstige putjes, voeg 50 µl enzymconjugaatoplossing toe.Meng voorzichtig door de plaat handmatig te schudden en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ℃ met deksel.

9.2.7Wassen: Verwijder voorzichtig het deksel en giet de vloeistof uit de wells en spoel de microwells met 250µl verdunde wasoplossing (oplossing6) met een interval van 10 seconden gedurende 4-5 keer.Absorbeer het resterende water met absorberend papier (de resterende luchtbel kan worden verwijderd met een ongebruikte tip).

9.2.8Kleur: Voeg 50 µl substraatoplossing A en 50 µl substraatoplossing B toe aan elk putje.Meng voorzichtig door de plaat handmatig te schudden en incubeer gedurende 15 minuten bij 25°C met deksel (zie 12.8).

9.2.11Meten: Voeg 50 µl stopoplossing toe aan elk putje.Meng voorzichtig door de plaat handmatig te schudden en meet de absorptie bij 450 nm (het stelde voor om te meten met de dubbele golflengte van 450/630 nm. Lees het resultaat binnen 5 minuten na toevoeging van de stopoplossing.)

10 Resultaten

10.1Percentage absorptie

De gemiddelde waarden van de absorptiewaarden verkregen voor de standaarden en de monsters worden gedeeld door de absorptiewaarde van de eerste standaard (nulstandaard) en vermenigvuldigd met 100%.Zo wordt de nulnorm gelijk gemaakt aan 100% en worden de absorptiewaarden in procenten weergegeven.

=

B ——absorptienorm (of monster)

B0 -- absorptie nul standaard

10.2Standaard bocht

----Om een ​​standaardkromme te tekenen: neem de absorptiewaarde van standaarden als y-as, semi-logaritmisch van de concentratie van de AOZ-standaardoplossing (ppb) als x-as.

---- De AOZ-concentratie van elk monster (ppb), die kan worden afgelezen van de kalibratiecurve, wordt vermenigvuldigd met de overeenkomstige verdunningsfactor van elk gevolgd monster en de werkelijke concentratie van het monster wordt verkregen.

Let alstublieft op:

Voor alle datareductie is speciale software ontwikkeld, die op aanvraag geleverd kan worden.

Verdunningsfactor………………………………………..……2

10.Gevoeligheid, nauwkeurigheid en precisie

Gevoeligheid: 0,025ppb

Detectie limiet:

Weefsel (spier, lever) ………………………… 0,1 ppb

Honing------------------------------------------------- -0,1ppb

Nauwkeurigheid:

Dierlijk weefsel (spier en lever) ……………… 100 ± 20%

Honing………………………………..………….... 100±20%

Precisie:CV van de ELISA-kit is minder dan 10%.

11.Kennisgeving

12.1 De gemiddelde waarden van de absorptiewaarden verkregen voor de standaarden en de monsters worden verlaagd als de reagentia en monsters niet op kamertemperatuur zijn gebracht (20-25℃).

12.2 Laat de microwells niet tussen de stappen drogen om mislukte reproduceerbaarheid te voorkomen en voer de volgende stap onmiddellijk uit nadat u op de microwells-houder tikt.

12.3 Schud elk reagens voorzichtig voor gebruik.

12.4 Houd uw huid uit de buurt van de stopoplossing, want deze is 0,5 MH₂SO₄oplossing.

12.5 Gebruik geen verouderde kits.Wissel de reagentia van verschillende batches niet uit, anders zal de gevoeligheid dalen.

12.6 Opslagconditie: Bewaar de ELISA-kits op 2-8 ℃, niet bevriezen.Sluit rustende microwell-platen af, vermijd direct zonlicht tijdens alle incubaties.Het wordt aanbevolen om de microtiterplaten af ​​te dekken.

12.7 Substraatoplossing moet worden opgegeven als deze verkleurt.De reagentia kunnen verslechteren als de absorptiewaarde (450/630nm) van de nulstandaard lager is dan 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 De kleuringsreactie heeft 15 minuten nodig na toevoeging van de substraatoplossing;U kunt de incubatietijd verlengen tot 20min of meer als de kleur te licht is om te bepalen. Overschrijd nooit de 25min. Integendeel, verkort de incubatietijd juist.

12.9 De optimale reactietemperatuur is 25℃.Hogere of lagere temperaturen leiden tot veranderingen in gevoeligheid en absorptiewaarden.

12.Bewaarconditie en bewaartermijn

Bewaarconditie: 2-8℃.

Bewaartermijn: 12 maanden.