Kompetitivt enzymimmunoanalyskit för kvantitativ analys av furazolidonmetabolit (AOZ)
- 1.Bakgrund
Nitrofuraner är syntetiska bredspektrumantibiotika, som ofta används i djurproduktion för sina utmärkta antibakteriella och farmakokinetiska egenskaper.De hade också använts som tillväxtfrämjare i gris-, fjäderfä- och vattenproduktion.I långtidsstudier med laboratoriedjur visade det sig att moderläkemedlen och deras metaboliter visade cancerogena och mutagena egenskaper.Detta har lett till ett förbud mot nitrofuraner för behandling av djur som används för livsmedelsproduktion.Nitrofuranläkemedlen furaltadon, nitrofurantoin och nitrofurazon förbjöds att användas i livsmedelsproduktion i EU 1993, och användningen av furazolidon förbjöds 1995.
Analysen av rester av nitrofuranläkemedel måste baseras på detektering av de vävnadsbundna metaboliterna av moderläkemedlen för nitrofuran.Eftersom moderläkemedlen metaboliseras mycket snabbt och de vävnadsbundna nitrofuranmetaboliterna kommer att bibehållas under lång tid, används dessa metaboliter som mål vid upptäckt av missbruk av nitrofuraner, vilket inkluderar Furazolidon-metabolit (AOZ), Furaltadon-metabolit (AMOZ) ), Nitrofurantoinmetabolit (AHD) och Nitrofurazonmetabolit (SEM).
AOZ-rester bestäms oftast av LC-MS eller LC-MS/MS.Enzymimmunanalyser, jämfört med kromatografiska metoder, visar avsevärda fördelar vad gäller känslighet, detektionsgräns, teknisk utrustning och tidsbehov.(Tidskostnad: 45min)
- 2.Testprincip
Detta ELISA-kit är utformat för att detektera AOZ baserat på principen om indirekt konkurrenskraftig enzymimmunanalys.Mikrotiterbrunnarna är belagda med infångnings-BSA-kopplat antigen.AOZ i provet konkurrerar med antigenet belagt på mikrotiterplattan om den tillsatta antikroppen.Efter tillsats av enzymkonjugat används kromogent substrat och signalen mäts med en spektrofotometer.Absorptionen är omvänt proportionell mot AOZ-koncentrationen i provet.
- 3.Ansökningar
Detta kit kan användas i kvantitativ och kvalitativ analys av AOZ-rester idjurvävnader(muskler, lever etc), honung.
- 4.Korsreaktioner
Furazolidonmetabolit (AOZ)…………………………..100 %
Furaltadonmetabolit (AMOZ)………………………<0,1 %
Nitrofurantoinmetabolit (AHD)…………………………<0,1 %
Nitrofurazonmetabolit (SEM)………………………<0,1 %
Furazolidon………………………………………………………..…16,3 %
Furaltadon……………………………………………………….…<1 %
Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1 %
Nitrofurazon…………………………………………………..…<1 %
- 5.Material som krävs
5.1Utrustning
---- Mikrotiterplattspektrofotometer (450nm/630nm)
---- Roterande förångare eller kvävetorkande instrument
---- Homogenisator / mage
----Shaker
----Vortexblandare
----Centrifug
----Analytisk balans (induktans: 0,01g)
---- Graderad pipett: 10ml
---- Gummipipett glödlampa
----Volymmetrisk kolv: 100ml
----Glaskolv: 10ml
----Polystyrencentrifugrör: 2ml, 50ml
----Mikropipetter: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multipipett
5.2Reagenser
---- Etylacetat (AR)
----n-hexan (eller n-heptan) (AR)
---- Dikaliumvätefosfattrihydrat
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Koncentrerad saltsyra (HCl, AR)
----- Metanol
----Natriumhydroxid (NaOH, AR)
----Avjoniserat vatten
- 6.Kitkomponenter
l Mikrotiterplatta belagd med antigen, 96 brunnar
l Standardlösningar (6 flaskor, 1 ml/flaska)
0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb
l Spiking standardkontroll: (1ml/flaska).......100 ppb
l Koncentrerat enzymkonjugat 1ml……..röd lock
l Enzymkonjugatspädningsmedel 10ml………..grönt lock
l Substrat A 7ml………………………………………………..…..vitt lock
l Substrat B 7ml……………………………………….…..röd lock
l Stopplösning 7ml…………………………………gult lock
l 20×koncentrerad tvättlösning 40ml
………………………………………….……transparent lock
l 2×koncentrerad extraktionslösning 60ml…blått lock
l 2-Nitrobensaldehyd 15,1mg………………vit lock
- 7.Reagensberedning
Lösning 1: derivatreagens:
Tillsätt 10 ml metanol till flaskan med 2-nitrobensaldehyd och lös upp.(vid koncentrationen 10 mM).
Lösning 2: 0,1 MK2HPO4lösning:
Väg 22,8g K2HPO4.3H2O till 1L avjoniserat vatten för att lösas upp.
Lösning 3: 1 M HCl-lösning
Lös upp 8,3 ml koncentrerad saltsyra med avjoniserat vatten till 100 ml.
Lösning 4:1 M NaOH-lösning
Lös 4 g NaOH med 100 ml avjoniserat vatten.
Lösning 5: extraktionslösning:
Späd 2×koncentrerad extraktionslösning med avjoniserat vatten i volymförhållandet 1:1.Denna lösning kan konserveras i 1 månad vid 4 ℃, som kommer att användas för att extrahera prover.
Lösning 6: tvättlösning:
Späd den 20xkoncentrerade tvättlösningen med avjoniserat vatten i volymförhållandet 1:19, som kommer att användas för att tvätta plattorna.Denna utspädda lösning kan bevaras i 1 månad vid 4 ℃.
- 8.Provförberedelser
8.1Meddelande och försiktighetsåtgärder före användning:
a) Använd engångsspetsar i experimentet och ändra spetsarna när du absorberar olika reagens.
b) Se till att alla experimentella instrument är rena.
c) derivatreagenset kan konserveras vid 2-8 ℃ i tre månader;
d) HCl-lösningen kan konserveras vid rumstemperatur i 3 månader;
e) NaOH-lösningen kan konserveras i 3 månader vid rumstemperatur;
f) Förvara obehandlade prover i frys (-20 ℃);
g) Behandlade prover kan konserveras i 24 timmar vid 2-8 ℃ i mörker.
8.2 Djurvävnads- och leverprover:
---- Homogenisera proverna med homogenisator;
----Vikt 1,0±0,05 g av det homogeniserade vävnadsprovet i 50 ml polystyrencentrifugrör.Tillsätt 4 ml avjoniserat vatten, 0,5 ml 1 M HCl-lösning och 100 ul derivatreagens (se lösning 1).Skaka den i 2 min.
---- Inkubera vid 37 ℃ över natten (ca 16 timmar);
---- Lägg till 5ml 0,1MK2HPO4 (lösning2), 0,4 ml 1 M NaOH (lösning4) och 5 ml etylacetat.Skaka häftigt i 30-talet;
---- Centrifugera vid rumstemperatur (20-25 ℃) i 10 minuter, minst 3000g;
---- Ta 2,5 ml av supernatantens organiska fas i ett 10 ml rent glasrör, torka med 50-60 ℃ kvävgas eller rotationsindunstare;
---- Lös upp den torra resten med 1 ml n-hexan (eller n-heptan), vortexa i 30 sekunder, tillsätt 1 ml extraktionslösning (lösning5), vortexa 1 min, blanda helt.
---- Centrifugera vid rumstemperatur (20-25oC) i 5 min, minst 3000g;
---- Avlägsna supernatantens organiska fas;ta 50 μl av substratets vattenfas för analys.
8.4 Honung
----väg 1,0±0,05 g av det homogeniserade honungsprovet i ett 50 ml polystyrencentrifugrör;
----Tillsätt 4ml avjoniserat vatten, 0,5ml 1M HCl (lösning3) och 100 μl derivatreagens (lösning1);skaka helt i 2min;
----Inkubera vid 37 ℃ över natten (ca 16 timmar);
----Tillsätt 5ml 0,1MK2HPO4 (lösning2), 0,4 ml 1 M NaOH (lösning4) och 5 ml etylacetat, skaka kraftigt i 30 s;
----Centrifugera vid rumstemperatur (20-25 ℃) i 10 minuter, minst 3000g;
----Ta 2,5 ml av supernatantens organiska fas i ett 10 ml rent glasrör, torka med 50-60 ℃ kvävgas eller rotationsindunstare;
---- Lös upp den torra resten med 1 ml n-hexan (eller n-heptan), vortexa i 30 sekunder, tillsätt 1 ml extraktionslösning (lösning5), vortexa 1 min, blanda helt.
----Centrifugera vid rumstemperatur (20-25oC) under 10 min, minst 3000 g;
----Ta bort supernatantens organiska fas;ta 50 μl av substratets vattenfas för analys.
- 9.Analysprocess
9.1Observera före analys
9.1.1 Se till att alla reagenser och mikrobrunnar har rumstemperatur (20-25 ℃).
9.1.2 Återställ alla övriga reagenser till 2-8 ℃ omedelbart efter användning.
9.1.3 Att tvätta mikrobrunnarna korrekt är ett viktigt steg i analysprocessen;det är den avgörande faktorn för reproducerbarheten av ELISA-analysen.
9.1.4 Undvik ljuset och täck över mikrobrunnarna under inkubationen.
9.2 Analyssteg
9.2.1 Ta ut alla reagenser vid rumstemperatur (20-25 ℃) i mer än 30 minuter, homogenisera före användning.
9.2.2 Ta ut de mikrobrunnar som behövs och lägg tillbaka resten i zip-lock-påsen vid 2-8 ℃ omedelbart.
9.2.3 Den koncentrerade tvättlösningen och den koncentrerade extraktionslösningen bör värmas upp till rumstemperatur före användning.
9.2.4Siffra:Numrerade varje mikrobrunnspositioner och alla standarder och prover ska köras i duplikat.Anteckna standarder och provpositioner.
9.2.5Spädning av koncentrerad antikroppslösning: späd den koncentrerade enzymlösningen med enzymkonjugatspädningsmedel i volymförhållandet 1:10 (1-faldig koncentrerad enzymlösning: 10-faldig enzymkonjugat-spädningsmedel).
9.2.6Tillsätt standardlösning/prov och enzymkonjugatlösning: tillsätt 50 µl standardlösning eller preparerat prov till motsvarande brunnar, tillsätt 50 µl enzymkonjugatlösning.Blanda försiktigt genom att skaka plattan manuellt och inkubera i 30 minuter vid 25 ℃ med lock.
9.2.7Tvätta: Ta bort locket försiktigt och häll vätskan ur brunnarna och skölj mikrobrunnarna med 250 µl utspädd tvättlösning (lösning6) med 10s intervall i 4-5 gånger.Absorbera restvattnet med absorberande papper (resten luftbubbla kan elimineras med oanvänd spets).
9.2.8Färgsättning: Tillsätt 50 µl substratlösning A och 50 ul substratlösning B till varje brunn.Blanda försiktigt genom att gunga plattan manuellt och inkubera i 15 minuter vid 25 ℃ med lock (se 12.8).
9.2.11Mäta: Tillsätt 50 µl stopplösningen till varje brunn.Blanda försiktigt genom att gunga plattan manuellt och mät absorbansen vid 450 nm (Det föreslogs mätning med dubbelvåglängden 450/630 nm. Läs resultatet inom 5 minuter efter tillsats av stopplösning. )
10 Resultat
10.1Procentuell absorbans
Medelvärdena för absorbansvärdena som erhållits för standarderna och proverna divideras med absorbansvärdet för den första standarden (nollstandard) och multipliceras med 100 %.Nollstandarden görs således lika med 100 % och absorbansvärdena anges i procent.
=
B ——absorbansstandard (eller prov)
B0 ——absorbans noll standard
10.2Standardkurva
----Att rita en standardkurva: Ta absorbansvärdet för standarder som y-axel, semilogaritmisk av koncentrationen av AOZ-standardlösningen (ppb) som x-axel.
---- AOZ-koncentrationen för varje prov (ppb), som kan avläsas från kalibreringskurvan, multipliceras med motsvarande utspädningsfaktor för varje prov som följs, och den faktiska koncentrationen av provet erhålls.
Snälla lägg märke till:
Speciell mjukvara har utvecklats för all datareduktion, som kan tillhandahållas på begäran.
Utspädningsfaktor…………………………………………..……2
10.Känslighet, noggrannhet och precision
Känslighet: 0,025 ppb
Detektionsgräns:
Vävnad (muskel, lever)…………………………0.1ppb
Honung------------------------------------------------- -0,1 ppb
Noggrannhet:
Animalisk vävnad (muskel och lever)…………………………100±20 %
Honung………………………………..……………….... 100±20 %
Precision:CV för ELISA-kitet är mindre än 10 %.
11.Lägga märke till
12.1 Medelvärdena för absorbansvärdena som erhållits för standarderna och proverna kommer att reduceras om reagenserna och proverna inte har reglerats till rumstemperatur (20-25℃).
12.2 Låt inte mikrobrunnar torka mellan stegen för att undvika misslyckad reproducerbarhet och kör nästa steg omedelbart efter att ha knackat på mikrobrunnars hållare.
12.3 Skaka varje reagens försiktigt före användning.
12.4 Håll din hud borta från stopplösningen för det är 0,5MH2SO4lösning.
12.5 Använd inte kiten föråldrade.Byt inte ut reagenserna från olika satser, annars kommer det att minska känsligheten.
12.6 Förvaringsvillkor: Förvara ELISA-kit vid 2-8 ℃, frys inte.Försegla vila mikrobrunnsplattor, Undvik rakt solljus under alla inkubationer.Det rekommenderas att täcka mikrotiterplattorna.
12.7 Substratlösning bör överges om den får färg.Reagenserna kan försämras om absorbansvärdet (450/630nm) för nollstandarden är mindre än 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Färgningsreaktionen behöver 15 minuter efter tillsats av substratlösning;Du kan förlänga inkubationstiden till 20 minuter eller mer om färgen är för ljus för att kunna bestämmas. Överskrid aldrig 25 minuter. Tvärtom, förkorta inkubationstiden ordentligt.
12.9 Den optimala reaktionstemperaturen är 25℃.Högre eller lägre temperatur kommer att leda till förändringar av känslighets- och absorbansvärden.
12.Lagringsskick och lagringstid
Lagringsskick: 2-8℃.
Lagringstid: 12 månader.
