önüm

1. 1.Düşündiriş

Nitrofurans sintetiki giň spektrli antibiotikler bolup, ajaýyp antibakterial we farmakokinetiki aýratynlyklary üçin haýwan önümçiliginde ýygy-ýygydan ulanylýar.Şeýle hem doňuz, guş we suw önümçiliginde ösüşi ösdüriji hökmünde ulanyldy.Laboratoriýa haýwanlary bilen uzak möhletleýin gözleglerde esasy dermanlaryň we olaryň metabolitleriniň kanserogen we mutagen aýratynlyklaryny görkezendigi görkezildi.Bu azyk önümçiliginde ulanylýan haýwanlary bejermek üçin nitrofuranyň gadagan edilmegine sebäp boldy.1993-nji ýylda nitB-de azyk haýwanlaryny öndürmekde nitrofuran dermanlary furaltadon, nitrofurantoin we nitrofurazon gadagan edildi we 1995-nji ýylda furazolidonyň ulanylmagy gadagan edildi.

Nitrofuran dermanlarynyň galyndysynyň seljermesi, nitrofuranyň esasy dermanlarynyň dokuma bagly metabolitlerini kesgitlemäge esaslanmalydyr.Esasy dermanlar örän çalt metabolizlenýär we dokuma bagly nitrofuran metabolitleri uzak wagtlap saklanýandygy sebäpli, bu metabolitler Furazolidon metabolitini (AOZ), Furaltadon metabolitini (AMOZ) öz içine alýan nitrofuranyň hyýanatçylykly ulanylmagyny ýüze çykarmakda maksat hökmünde ulanylýar. ), Nitrofurantoin metaboliti (AHD) we Nitrofurazon metaboliti (SEM).

AOZ-galyndylary köplenç LC-MS ýa-da LC-MS / MS tarapyndan kesgitlenýär.Ferment immunoassaýlary, hromatografiki usullar bilen deňeşdirilende, duýgurlyk, kesgitleme çäkleri, tehniki enjamlar we wagt talaplary babatynda ep-esli artykmaçlygy görkezýär.(Wagtyň bahasy: 45min)

1. 2.Synag ýörelgesi

Bu ELISA toplumy, gytaklaýyn bäsdeşlik ferment immunoassaý prinsipi esasynda AOZ-ny ýüze çykarmak üçin döredildi.Mikrotiter guýulary BSA bilen baglanyşykly antigen bilen örtülendir.Mysal üçin AOZ, goşulan antikor üçin mikrotiter plastinkasynda örtülen antigen bilen bäsleşýär.Ferment konýugaty goşulandan soň, hromogen substrat ulanylýar we signal spektrofotometr bilen ölçelýär.Siňdiriş, nusgadaky AOZ konsentrasiýasyna ters proporsionaldyr.

1. 3.Goýmalar

Bu toplum, AOZ galyndysynyň mukdar we hil derňewinde ulanylyp bilnerAnima dokumalary(myşsa, bagyr we ş.m.), bal.

1. 4.Kesgitli reaksiýalar

Furazolidon metaboliti (AOZ) …………………… ..100%

Furaltadon metaboliti (AMOZ) …………………… <0,1%

Nitrofurantoin metaboliti (AHD) …………………… <0,1%

Nitrofurazon metaboliti (SEM) ………………… ...… <0,1%

Furazolidon ……………………………….… ..… 16.3%

Furaltadon ………………………………….… <1%

Nitrofurantoin ………………………………. …….… <1%

Nitrofurazon …………………………………… ..… <1%

1. 5.Gerekli materiallar

5.1Enjamlar

---- Mikrotiter plastinka spektrofotometr (450nm / 630nm)

---- Aýlanýan bugarýan ýa-da azot guradyjy gurallar

---- Gomogenizator / stomacher

---- Şaker

---- Worteks mikser

---- Merkezden gaçyryş

---- Analitik deňagramlylyk (induksion: 0.01g)

---- Gutaran turba: 10ml

---- Kauçuk turbalar

---- Volumetriki çüýşe: 100ml

---- Aýna çüýşe: 10ml

---- Polistirol sentrifuga turbasy: 2ml, 50ml

---- Mikropipetler: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul köp sanly

5.2Reagentler

---- Etil asetat (AR)

---- n-heksan (ýa-da n-heptan) (AR)

---- Dipotassi wodorod fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Konsentrirlenen gidroklor turşusy (HCl, AR)

----- Metanol

---- Natriý gidroksidi (NaOH, AR)

---- Deionlaşdyrylan suw

1. 6.Kit komponentleri

l Antigen bilen örtülen mikrotiter plastinka, 96 guýy

l Adaty çözgütler (6 çüýşe, 1ml / çüýşe)

0ppb, 0.025ppb, 0.075ppb, 0.225ppb, 0.675ppb, 2.025ppb

l Göçme standart dolandyryş: (1ml / çüýşe) ....….100ppb

l Konsentrirlenen ferment konjugaty 1ml ...… .. gapak

l Ferment konýugat erginleri 10ml ……… .. ýaşyl gapak

l 7ml substrat ……… ..............… ....… ..… .. ak gapak

l Substrat B 7ml ……… ..............… ........…

l 7ml çözgüdi duruzyň …………………………… sary gapak

l 20 × konsentrirlenen ýuwujy ergin 40ml

……………………………………. …… aç-açan gapak

l 2 × konsentrirlenen çykaryş ergini 60ml…

l 2-Nitrobenzaldegid 15.1mg ……………… ak gapak

1. 7.Reagentleri taýýarlamak

Çözgüt 1: emele gelen reagent:

2-Nitrobenzaldegidli çüýşe 10ml metanol goşuň we eritiň.(10mM konsentrasiýasynda).

Çözgüt 2: 0.1MK₂HPO₄çözgüt:

Agramy 22,8g K.₂HPO₄.3H₂Eremek üçin O-dan 1L deionizirlenen suw.

Çözgüt 3: 1M HCl çözgüdi

8.3ml konsentrirlenen gidroklor turşusyny eritiň deionizirlenen suw bilen 100ml.

Çözgüt 4:1M NaOH çözgüdi

4g NaOH-ny 100ml deionizirlenen suw bilen eritiň.

Çözgüt 5: çykarmak çözgüdi:

2 × konsentrirlenen çykaryş erginini 1: 1 nisbatynda deionizirlenen suw bilen garyşdyryň.Bu ergini 1 aýda 4 at saklap bolýar, bu nusgalary almak üçin ulanylar.

Çözgüt 6: ýuwmak ergini:

Tabaklary ýuwmak üçin ulanyljak 20 × konsentrirlenen ýuwujy ergini 1:19 ses derejesinde deionizirlenen suw bilen garyşdyryň.Bu suwuklandyrylan ergini 4 at 1 aýlap saklap bolýar.

1. 8.Nusga taýýarlyklary

8.1Işlemezden ozal duýduryş we seresaplyklar:

a) Synagda bir gezeklik maslahatlary ulanyň we dürli reagenti siňdireniňizde maslahatlary üýtgediň.

b) Synag gurallarynyň hemmesiniň arassadygyna göz ýetiriň.

ç) emele gelen reagent 2-8 at üç aýlap saklanyp bilner;

d) HCl ergini otag temperaturasynda 3 aý saklanyp bilner;

e) NaOH erginini otag temperaturasynda 3 aý saklap bolýar;

f) Bejerilmedik nusgalary doňduryň (-20 ℃);

g) Bejerilen nusgalary 24-8 sagat garaňkylykda saklap bolýar.

8.2 Haýwan dokumalary we bagyr nusgalary:

---- Nusgalary gomogenizator bilen birleşdiriň;

---- Agramy 1,0 ± 0.05g birmeňzeş dokumanyň nusgasy 50ml polistirol sentrifuga turbasyna.4ml deionizirlenen suw, 0,5ml 1M HCl ergini we 100ul emele gelen reagent goşuň (1-nji çözgüde serediň).2 minut silkelemeli.

---- Bir gije 37 at inkubasiýa (takmynan 16s);

---- 5ml 0.1MK goşuň₂HPO₄ (çözgüt2), 0,4ml 1M NaOH (çözgüt4) we 5ml etil asetat.30-njy ýyllar üçin gaty sarsyň;

---- Otag temperaturasynda sentrifuga (20-25 ℃) 10 minut, azyndan 3000g;

---- 2,5ml adatdan daşary organiki fazany 10ml arassa aýna turba alyň, 50-60 rogen azot gazy ýa-da aýlanýan bugarýan bilen guradyň;

---- Gury galyndylary 1ml n-heksan (ýa-da n-heptan), worteks bilen 30-a bölüň, 1ml çykarmak erginini goşuň (çözgüt5), worteks 1min, doly garmaly.

---- Otag temperaturasynda sentrifuga (20-25^oC) 5min, azyndan 3000g;

---- Adatdan daşary organiki fazany aýyryň;Derňew üçin substrat suw fazasynyň 50μlini alyň.

8.4 Bal

---- birmeňzeş bal nusgasynyň 1,0 ± 0.05g agramy 50ml polistirol sentrifuga turbasyna;

---- 4ml deionizirlenen suw, 0,5ml 1M HCl goşuň (çözgüt3) we 100μl emele gelen reagent (çözgüt1);2 minut doly sarsdyryň;

---- Bir gije 37 at inkubasiýa (takmynan 16s);

---- 5ml 0.1MK goşuň₂HPO₄ (çözgüt2), 0,4ml 1M NaOH (çözgüt4) we 5ml etil asetat, 30-njy ýyllar üçin gaty sarsyň;

---- Otag temperaturasynda sentrifuga (20-25 ℃) 10 minut, azyndan 3000g;

---- 2,5ml adatdan daşary organiki fazany 10ml arassa aýna turba alyň, 50-60 rogen azot gazy ýa-da aýlanýan bugarýan bilen guradyň;

---- Gury galyndylary 1ml n-heksan (ýa-da n-heptan), worteks bilen 30-a bölüň, 1ml çykarmak erginini goşuň (çözgüt5), worteks 1min, doly garmaly.

---- Otag temperaturasynda sentrifuga (20-25^oC) 10min, azyndan 3000g;

---- Adatdan daşary organiki fazany aýyryň;Derňew üçin substrat suw fazasynyň 50μlini alyň.

1. 9.Derňew prosesi

9.1Derňewden öň duýduryş beriň

9.1.1 rehli reagentleriň we mikrotolkunlaryň hemmesiniň otag temperaturasynda bolandygyna göz ýetiriň (20-25 ℃).

9.1.2 Galan reagentleriň hemmesini ulanylandan soň derrew 2-8 to yzyna gaýtaryň.

9.1.3 Mikrotolkunlary dogry ýuwmak, barlag işinde möhüm ädimdir;ELISA derňewiniň köpelmegi üçin möhüm faktor.

9.1.4 lightagtylykdan gaça duruň we inkubasiýa wagtynda mikrotolkunlary ýapyň.

9.2 Derňew ädimleri

9.2.1 Reagentleri otag temperaturasynda (20-25 ℃) 30 minutdan gowrak çykaryň, ulanmazdan ozal birleşdiriň.

9.2.2 Gerekli mikrotolkunlary alyň we galanlaryny derrew 2-8 at aralygynda zip-gulp haltasyna gaýtaryň.

9.2.3 Konsentrirlenen ýuwujy ergin we konsentrirlenen çykarmak ergini, ulanmazdan ozal otag temperaturasynda bolmaly.

9.2.4Belgi:Her mikrotolkun pozisiýasyny sanap, ähli standartlar we nusgalar iki nusgada işlemeli.Standartlary we nusgalaryň ýagdaýyny ýazga alyň.

9.2.5Konsentrirlenen antikor erginini eritmek: konsentrirlenen ferment erginini 1: 10 nisbatynda ferment konýugat erginleri bilen eritmek (1 esse konsentrirlenen ferment ergini: 10 esse ferment konýugat erginleri).

9.2.6Adaty çözgüt / nusga we ferment konýugat erginini goşuň: degişli guýulara 50µl standart ergin ýa-da taýýarlanan nusga goşuň, 50µl ferment konýugat erginini goşuň.Tabagy el bilen silkip, ýuwaşlyk bilen garmaly we gapagy bilen 25 at 30 minut inkubasiýa etmeli.

9.2.7Washuwuň: Gapagy ýuwaşlyk bilen aýyryň we suwuklygy guýulardan guýuň we mikrotolkunlary 250µl suwuklandyrylan ýuwujy ergin bilen ýuwuň (çözgüt6) 10s aralygynda 4-5 gezek.Galyndy suwy siňdiriji kagyz bilen siňdiriň (galan howa köpügi ulanylmadyk uç bilen ýok edilip bilner).

9.2.8Reňk: Her guýa 50µl substrat ergini A we 50ul substrat ergini goşuň.Tabagy el bilen silkip, ýuwaşlyk bilen garmaly we 15 cover gapak bilen 15 minut inkubasiýa ediň (12.8 seret).

9.2.11Ölçe: Her guýa 50µl durmak çözgüdi goşuň.Tabagy el bilen silkip, ýuwaşlyk bilen garyşdyryň we sorulmagyny 450nm-de ölçäň (450/630nm goşa tolkun uzynlygy bilen ölçemegi teklip etdi. Durmak ergini goşulandan soň 5 minutyň içinde netijäni okaň.)

10 Netijeler

10.1Göterim siňdirişi

Standartlar we nusgalar üçin alnan siňdiriş bahalarynyň ortaça bahalary birinji standartyň (nol standart) siňdiriş bahasy bilen bölünýär we 100% köpelýär.Şeýlelik bilen nol standart 100% deňdir we siňdiriş bahalary göterimlerde getirilýär.

=

B ——absorbance standarty (ýa-da nusga)

B0 —— sorulma nol standart

10.2Standart egrilik

---- Adaty egrini çyzmak üçin: ülňüleriň siňdiriş bahasyny y oky, AOZ standart ergininiň (ppb) konsentrasiýasynyň ýarym logarifmiki görnüşi hökmünde alyň.

---- Kalibrleme egrisinden okap boljak her nusganyň (ppb) AOZ konsentrasiýasy, her nusganyň degişli eritme faktoryna köpelýär we nusganyň hakyky konsentrasiýasy alynýar.

Üns beriň:

Talap boýunça üpjün edilip bilinjek ähli maglumatlary azaltmak üçin ýörite programma üpjünçiligi işlenip düzüldi.

Erginleme faktory………………………………… .. …… 2

10.Duýgurlyk, takyklyk we takyklyk

Duýgurlyk: 0.025ppb

Ectionüze çykarmak çägi:

Dokum (myşsa, bagyr) ………………………… 0.1ppb

Bal ------------------------------------------------- -0.1ppb

Takyklyk:

Haýwan dokumasy (myşsa we bagyr) …… ... ………… 100 ± 20%

Bal ……………………………… .. ………… .... 100 ± 20%

Takyklyk:ELISA toplumynyň CV-i 10% -den az.

11.Üns beriň

12.1 Reagentler we nusgalar otag temperaturasyna (20-25 ℃) kadalaşdyrylmadyk bolsa, ülňüler we nusgalar üçin alnan siňdiriş bahalarynyň ortaça bahalary azalýar.

12.2 Üstünlikli köpelmezlik üçin ädimleriň arasynda mikrotolkunlaryň guramagyna ýol bermäň we mikrotolkunlaryň eýesine degeniňizden soň indiki ädimiňizi işlediň.

12.3 Ulanylmazdan ozal her reagenti ýuwaşja silkäň.

12.4 Deriňizi saklaýyş ergininden daşda saklaň, sebäbi ol 0,5MH₂SO₄çözgüt.

12.5 Kitaplary köne ulanmaň.Dürli partiýalaryň reagentlerini çalyşmaň, ýogsam duýgurlygy peselder.

12.6 Saklamagyň ýagdaýy: ELISA toplumlaryny 2-8 at derejesinde saklaň, doňmaň.Dynç alýan mikrotolkun plitalaryny möhürläň, ähli inkubasiýa wagtynda göni gün şöhlesinden gaça duruň.Mikrotiter plitalaryny ýapmak maslahat berilýär.

12.7 Substrat ergini reňk öwürse terk edilmelidir.Nol standartyň siňdiriş bahasy (450 / 630nm) 0,5 (A450nm <0.5) -den pes bolsa, reagentler ýaramazlaşyp biler.

12.8 Substrat ergini goşulandan soň reňk reaksiýasy 15 minut gerek;Reňk kesgitlenip bilinmeýän bolsa, inkubasiýa wagtyny 20min ýa-da ondanam köpeldip bilersiňiz. Hiç haçan 25min-den geçmeli däl. Tersine, inkubasiýa wagtyny dogry gysgaldyň.

12.9 Iň amatly reaksiýa temperaturasy 25 ℃.Higherokary ýa-da pes temperatura duýgurlygyň we siňdiriş bahalarynyň üýtgemegine getirer.

12.Saklamagyň ýagdaýy we saklanyş möhleti

Saklamagyň ýagdaýy: 2-8 ℃.

Saklamak möhleti: 12 aý.