producto

1. 1.Antecedentes

Los nitrofuranos son antibióticos sintéticos de amplio espectro, que se emplean con frecuencia en la producción animal por sus excelentes propiedades antibacterianas y farmacocinéticas.También se han utilizado como promotores del crecimiento en la producción porcina, avícola y acuática.En estudios a largo plazo con animales de laboratorio se indicó que los fármacos originales y sus metabolitos mostraban características cancerígenas y mutagénicas.Esto ha llevado a la prohibición de los nitrofuranos para el tratamiento de animales utilizados para la producción de alimentos.En 1993 se prohibió el uso de furaltadona, nitrofurantoína y nitrofurazona en la producción de alimentos para animales en la UE, y el uso de furazolidona se prohibió en 1995.

El análisis de los residuos de nitrofuranos debe basarse en la detección de los metabolitos ligados a los tejidos de los nitrofuranos originales.Dado que los fármacos originales se metabolizan muy rápidamente y los metabolitos de nitrofurano unidos a los tejidos se retendrán durante mucho tiempo, estos metabolitos se utilizan como objetivo en la detección del abuso de nitrofuranos, que incluyen el metabolito de furazolidona (AOZ), el metabolito de furaltadona (AMOZ ), metabolito de nitrofurantoína (AHD) y metabolito de nitrofurazona (SEM).

Los residuos de AOZ se determinan más comúnmente mediante LC-MS o LC-MS/MS.Los inmunoensayos enzimáticos, en comparación con los métodos cromatográficos, muestran ventajas considerables en cuanto a sensibilidad, límite de detección, equipo técnico y requisitos de tiempo.(Coste de tiempo: 45min)

1. 2.Principio de prueba

Este kit ELISA está diseñado para detectar AOZ según el principio del inmunoensayo enzimático competitivo indirecto.Los pocillos de microtitulación están recubiertos con antígeno de captura ligado a BSA.El AOZ en la muestra compite con el antígeno recubierto en la placa de microtitulación por el anticuerpo agregado.Después de la adición del conjugado enzimático, se usa sustrato cromogénico y la señal se mide con un espectrofotómetro.La absorción es inversamente proporcional a la concentración de AOZ en la muestra.

1. 3.Aplicaciones

Este kit se puede utilizar en el análisis cuantitativo y cualitativo de residuos de AOZ entejidos de ánima(músculo, hígado, etc.), miel.

1. 4.Reacciones cruzadas

Metabolito de furazolidona (AOZ)……………………..100%

Metabolito de furaltadona (AMOZ)……………………<0,1%

Metabolito de nitrofurantoína (AHD)……………………<0,1%

Metabolito de nitrofurazona (SEM)……………………...…<0.1%

Furazolidona…………………………………….…..…16,3%

Furaltadona……………………………………………….…<1%

Nitrofurantoína…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazona…………………………………………..…<1%

1. 5.Materiales necesarios

5.1Equipos

----Espectrofotómetro de placa de microtitulación (450nm/630nm)

----Evaporador rotatorio o instrumentos de secado de nitrógeno

----Homogeneizador/stomacher

----Criba vibradora

----Mezclador Vortex

----Centrífugo

----Balanza analítica (inductancia: 0.01g)

----Pipeta graduada: 10ml

---- Bulbo de pipeta de goma

---- Matraz aforado: 100ml

---- Frasco de vidrio: 10ml

----Tubo de centrífuga de poliestireno: 2ml, 50ml

----Micropipetas: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipeta

5.2reactivos

---- Acetato de etilo (AR)

----n-hexano (o n-heptano) (AR)

----Dipotásico hidrogenofosfato trihidrato

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Ácido clorhídrico concentrado (HCl, AR)

-----Metanol

---- Hidróxido de sodio (NaOH, AR)

----Agua desionizada

1. 6.Componentes del equipo

l Placa de microtitulación recubierta con antígeno, 96 pocillos

l soluciones estándar (6 botellas, 1ml/botella)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Control estándar de enriquecimiento: (1ml/botella)....….100ppb

l Conjugado enzimático concentrado 1ml...…..tapa roja

l Diluyentes de conjugados enzimáticos 10ml…………..tapa verde

l Substrato A 7ml………..............…....…..…..tapa blanca

l Substrato B 7ml………..............…........….…..tapa roja

l Solución de parada 7ml…………………………tapa amarilla

l 20×solución de lavado concentrada 40ml

……………………………………….……tapa transparente

l 2×solución de extracción concentrada 60ml….tapa azul

l 2-nitrobenzaldehído 15,1 mg………………tapa blanca

1. 7.Preparación de reactivos

Solución 1: reactivo derivado:

Agregue 10 ml de metanol a la botella que contiene 2-nitrobenzaldehído y disuelva.(a la concentración de 10 mM).

Solución 2: 0.1MK₂HPO₄solución:

Peso 22,8gK₂HPO₄.3H₂O a 1L de agua desionizada para disolver.

Solución 3: solución de HCl 1M

Disolver 8,3 ml de ácido clorhídrico concentrado con agua desionizada a 100ml.

Solución 4:Solución de NaOH 1M

Disuelva 4 g de NaOH con 100 ml de agua desionizada.

Solución 5: solución de extracción:

Diluya la solución de extracción concentrada 2x con agua desionizada en una proporción de volumen de 1:1.Esta solución se puede conservar durante 1 mes a 4 ℃, que se utilizará para extraer muestras.

Solución 6: solución de lavado:

Diluir la solución de lavado concentrada 20X con agua desionizada en la proporción de volumen de 1:19, que se utilizará para lavar las placas.Esta solución diluida se puede conservar durante 1 mes a 4℃.

1. 8.Preparaciones de muestra

8.1Aviso y precauciones antes de la operación:

a) Utilice puntas únicas en el experimento y cambie las puntas cuando absorba un reactivo diferente.

b) Asegúrese de que todos los instrumentos experimentales estén limpios.

c) el reactivo derivado se puede conservar a 2-8 ℃ durante tres meses;

d) La solución de HCl se puede conservar a temperatura ambiente durante 3 meses;

e) La solución de NaOH se puede conservar durante 3 meses a temperatura ambiente;

f) Mantenga las muestras no tratadas congeladas (-20 ℃);

g) Las muestras tratadas se pueden conservar durante 24 horas a 2-8 ℃ en la oscuridad.

8.2 Muestras de hígado y tejido animal:

----Homogeneizar las muestras con homogeneizador;

----Pese 1,0±0,05 g de la muestra de tejido homogeneizado en un tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml.Añadir 4 ml de agua desionizada, 0,5 ml de solución de HCl 1 M y 100 ul de reactivo derivado (ver solución 1).Agitar durante 2 min.

---- Incubar a 37 ℃ durante la noche (alrededor de 16 h);

---- Añadir 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solución2), 0,4 ml de NaOH 1 M (solución4) y 5 ml de acetato de etilo.Agitar ferozmente durante 30 s;

---- Centrifugue a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min, al menos 3000 g;

---- Tomar 2,5 ml de la fase orgánica sobrenadante en un tubo de vidrio limpio de 10 ml, secar con gas nitrógeno a 50-60 ℃ o evaporador rotatorio;

---- Disuelva los restos secos con 1 ml de n-hexano (o n-heptano), agite en vórtex durante 30 s, agregue 1 ml de solución de extracción (solución5), vortex 1min, mezcle completamente.

---- Centrifugar a temperatura ambiente (20-25^oC) durante 5 min, al menos 3000 g;

---- Eliminar la fase orgánica sobrenadante;tome 50 μl de la fase de agua del sustrato para el ensayo.

8.4 Miel

---- pesar 1,0 ± 0,05 g de la muestra de miel homogeneizada en un tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml;

----Agregue 4 ml de agua desionizada, 0,5 ml de HCl 1M (solución3) y 100 μl de reactivo derivado (solución1);agitar completamente durante 2 min;

----Incubar a 37℃ durante la noche (alrededor de 16h);

----Añadir 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solución2), 0,4 ml de NaOH 1 M (solución4) y 5 ml de acetato de etilo, agitar intensamente durante 30 s;

---- Centrifugar a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min, al menos 3000 g;

---- Tome 2,5 ml de la fase orgánica sobrenadante en un tubo de vidrio limpio de 10 ml, séquelo con gas nitrógeno a 50-60 ℃ o evaporador rotatorio;

----Disuelva los restos secos con 1 ml de n-hexano (o n-heptano), agite en el vórtice durante 30 s, agregue 1 ml de solución de extracción (solución5), vortex 1min, mezcle completamente.

----Centrifugar a temperatura ambiente (20-25^oC) durante 10 min, al menos 3000 g;

----Retirar la fase orgánica sobrenadante;tome 50 μl de la fase de agua del sustrato para el ensayo.

1. 9.proceso de ensayo

9.1Aviso antes del ensayo

9.1.1 Asegúrese de que todos los reactivos y micropocillos estén a temperatura ambiente (20-25 ℃).

9.1.2 Regrese todos los demás reactivos a 2-8 ℃ inmediatamente después de su uso.

9.1.3 El lavado correcto de los micropocillos es un paso importante en el proceso de ensayo;es el factor vital para la reproducibilidad del análisis ELISA.

9.1.4 Evite la luz y cubra los micropocillos durante la incubación.

9.2 Pasos del ensayo

9.2.1 Retire todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante más de 30 minutos, homogeneícelos antes de usarlos.

9.2.2 Saque los micropocillos necesarios y devuelva el resto a la bolsa con cierre hermético a 2-8 ℃ inmediatamente.

9.2.3 La solución de lavado concentrada y la solución de extracción concentrada deben volver a calentarse a temperatura ambiente antes de su uso.

9.2.4Número:Numere todas las posiciones de los micropocillos y todos los estándares y muestras deben procesarse por duplicado.Registre las posiciones de los estándares y las muestras.

9.2.5Dilución de solución concentrada de anticuerpos: diluya la solución enzimática concentrada con diluyentes de conjugados enzimáticos en una proporción de volumen de 1:10 (1 vez de solución enzimática concentrada: 10 veces de diluyentes de conjugados enzimáticos).

9.2.6Agregar solución estándar/muestra y solución de enzima conjugada: agregue 50 µl de solución estándar o muestra preparada a los pocillos correspondientes, agregue 50 µl de solución de enzima conjugada.Mezcle suavemente agitando la placa manualmente e incube durante 30 min a 25 ℃ con tapa.

9.2.7Lavar: Retire la tapa con cuidado y vierta el líquido de los pocillos y enjuague los micropocillos con 250 µl de solución de lavado diluida (solución6) a intervalos de 10 s durante 4-5 veces.Absorba el agua residual con papel absorbente (el resto de burbujas de aire se puede eliminar con una punta sin usar).

9.2.8Coloración: Agregue 50 ul de solución de sustrato A y 50 ul de solución de sustrato B a cada pocillo.Mezclar suavemente balanceando la placa manualmente e incubar durante 15 min a 25 ℃ con tapa (ver 12.8).

9.2.11Medida: Agregue 50 µl de la solución de parada a cada pocillo.Mezcle suavemente balanceando la placa manualmente y mida la absorbancia a 450 nm (se sugiere medir con la longitud de onda dual de 450/630 nm. Lea el resultado dentro de los 5 minutos posteriores a la adición de la solución de parada).

10 Resultados

10.1Porcentaje de absorbancia

Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se dividen por el valor de absorbancia del primer estándar (estándar cero) y se multiplican por 100%.El estándar cero se hace así igual al 100% y los valores de absorbancia se expresan en porcentajes.

=

B ——estándar de absorbancia (o muestra)

B0 ——estándar cero de absorbancia

10.2Curva estándar

----Para dibujar una curva estándar: Tome el valor de absorbancia de los estándares como eje y, semilogarítmico de la concentración de la solución estándar AOZ (ppb) como eje x.

----La concentración de AOZ de cada muestra (ppb), que se puede leer en la curva de calibración, se multiplica por el factor de dilución correspondiente de cada muestra seguida y se obtiene la concentración real de la muestra.

Note por favor:

Se ha desarrollado un software especial para la reducción de todos los datos, que se puede proporcionar a pedido.

Factor de dilución…………………………………………..……2

10Sensibilidad, exactitud y precisión

Sensibilidad: 0.025ppb

Límite de detección:

Tejido (músculo, hígado)…………………………0.1ppb

Cariño------------------------------------------------- -0.1ppb

Precisión:

Tejido animal (músculo e hígado)……...…………100±20%

Miel………………………………..………….... 100±20%

Precisión:El CV del kit ELISA es inferior al 10 %.

11aviso

12.1 Los valores medios de los valores de absorbancia obtenidos para los estándares y las muestras se reducirán si los reactivos y las muestras no se han regulado a temperatura ambiente (20-25 ℃).

12.2 No permita que los micropocillos se sequen entre pasos para evitar una reproducibilidad fallida y opere el siguiente paso inmediatamente después de tocar el soporte de micropocillos.

12.3 Agite suavemente cada reactivo antes de usarlo.

12.4 Mantenga su piel alejada de la solución de parada porque es la 0.5MH₂SO₄solución.

12.5 No utilice los kits vencidos.No intercambie los reactivos de diferentes lotes, o de lo contrario disminuirá la sensibilidad.

12.6 Condiciones de almacenamiento: Mantenga los kits ELISA a 2-8 ℃, no los congele.Selle las placas de micropocillos de descanso. Evite la luz directa del sol durante todas las incubaciones.Se recomienda cubrir las placas de microtitulación.

12.7 La solución de sustrato debe abandonarse si cambia de color.Los reactivos pueden deteriorarse si el valor de absorbancia (450/630nm) del estándar cero es inferior a 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 La reacción de coloración necesita 15 minutos después de la adición de la solución de sustrato;Puede prolongar el tiempo de incubación a 20 minutos o más si el color es demasiado claro para determinarlo. Nunca exceda los 25 minutos. Por el contrario, acorte el tiempo de incubación adecuadamente.

12.9 La temperatura de reacción óptima es de 25 ℃.Una temperatura más alta o más baja conducirá a cambios en los valores de sensibilidad y absorbancia.

12Condiciones de almacenamiento y período de almacenamiento

Condiciones de almacenamiento: 2-8 ℃.

Período de almacenamiento: 12 meses.