produk

1. 1.Latar belakang

Nitrofurans ialah antibiotik spektrum luas sintetik, yang sering digunakan dalam pengeluaran haiwan untuk sifat antibakteria dan farmakokinetik yang sangat baik.Mereka juga telah digunakan sebagai penggalak pertumbuhan dalam pengeluaran babi, ayam dan akuatik.Dalam kajian jangka panjang dengan haiwan makmal menunjukkan bahawa ubat induk dan metabolitnya menunjukkan ciri karsinogenik dan mutagenik.Ini telah membawa kepada larangan nitrofurans untuk rawatan haiwan yang digunakan untuk pengeluaran makanan.Ubat nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin dan nitrofurazone telah diharamkan daripada digunakan dalam pengeluaran haiwan makanan di EU pada tahun 1993, dan penggunaan furazolidone telah dilarang pada tahun 1995.

Analisis sisa ubat nitrofuran perlu berdasarkan pengesanan metabolit terikat tisu ubat induk nitrofuran.Oleh kerana ubat-ubatan induk dimetabolismekan dengan sangat cepat, dan metabolit nitrofuran yang terikat pada tisu akan kekal lama, metabolit ini digunakan sebagai sasaran dalam pengesanan penyalahgunaan nitrofuran, yang termasuk metabolit Furazolidone (AOZ), metabolit Furaltadone (AMOZ). ), metabolit Nitrofurantoin (AHD) dan metabolit Nitrofurazone (SEM).

Sisa AOZ ditentukan paling biasa oleh LC-MS atau LC-MS/MS.Immunoassay enzim, berbanding dengan kaedah kromatografi, menunjukkan kelebihan yang besar mengenai kepekaan, had pengesanan, peralatan teknikal dan keperluan masa.(Kos masa: 45min)

1. 2.Prinsip Ujian

Kit ELISA ini direka untuk mengesan AOZ berdasarkan prinsip immunoassay enzim kompetitif tidak langsung.Telaga mikrotiter disalut dengan penangkapan antigen berkaitan BSA.AOZ dalam sampel bersaing dengan antigen yang disalut pada plat mikrotiter untuk antibodi yang ditambahkan.Selepas penambahan konjugat enzim, substrat kromogenik digunakan dan isyarat diukur dengan spektrofotometer.Penyerapan adalah berkadar songsang dengan kepekatan AOZ dalam sampel.

1. 3.Aplikasi

Kit ini boleh digunakan dalam analisis kuantitatif dan kualitatif sisa AOZ dalamtisu anima(otot, hati dll), madu.

1. 4.Tindak balas silang

Metabolit furazolidone (AOZ)……………………..100%

Metabolit Furaltadone (AMOZ)……………………<0.1%

Metabolit Nitrofurantoin (AHD)……………………<0.1%

Metabolit Nitrofurazone (SEM)……………………………<0.1%

Furazolidone………………………………………..…16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Bahan yang Diperlukan

5.1peralatan

----Spektrofotometer plat mikrotiter (450nm/630nm)

---- Alat penyejat berputar atau pengeringan nitrogen

----Penghomogen /perut

---- Goncang

----Pengadun vorteks

----Empar

----Imbangan analitikal (kearuhan: 0.01g)

----Pipet lulus: 10ml

---- Mentol pipet getah

----Kelalang isipadu: 100ml

----Kelalang kaca: 10ml

---- Tiub empar polistirena: 2ml, 50ml

----Mikropipet: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagen

----Etil asetat (AR)

----n-heksana (atau n-heptana) (AR)

----Dipotassium hidrogen fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Asid hidroklorik pekat (HCl, AR)

-----Methanol

----Natrium hidroksida (NaOH, AR)

----Air deionisasi

1. 6.Komponen Kit

l Plat mikrotiter disalut dengan antigen, 96 telaga

l Penyelesaian standard (6 botol, 1ml/botol)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Kawalan standard spiking : (1ml/botol)....….100ppb

l Enzim pekat konjugat 1ml...……. penutup merah

l Pencair konjugat enzim 10ml………..penutup hijau

l Substrat A 7ml……………………………………………...penutup putih

l Substrat B 7ml………………………………………………..tutup merah

l Hentikan larutan 7ml…………………………………… penutup kuning

l 20×larutan basuhan pekat 40ml

………………………………………………………. penutup lutsinar

l 2×larutan perahan pekat 60ml….penutup biru

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… penutup putih

1. 7.Penyediaan Reagen

Penyelesaian 1: reagen terbitan:

Tambah 10ml metanol ke dalam botol yang mempunyai 2-Nitrobenzaldehyde dan larutkan.(pada kepekatan 10mM).

Penyelesaian 2: 0.1MK₂HPO₄penyelesaian:

Berat 22.8g K₂HPO₄.3H₂O hingga 1L air ternyahion untuk larut.

Penyelesaian 3: Larutan HCl 1M

Larutkan 8.3ml Asid hidroklorik pekat dengan air ternyahion hingga 100ml.

Penyelesaian 4:larutan NaOH 1M

Larutkan 4g NaOH dengan 100ml air ternyahion.

Penyelesaian 5: penyelesaian pengekstrakan:

Cairkan 2×larutan pengekstrakan pekat dengan air ternyahion dalam nisbah isipadu 1:1.Penyelesaian ini boleh dipelihara selama 1 bulan pada 4 ℃, yang akan digunakan untuk mengekstrak sampel.

Penyelesaian 6: larutan pencuci:

Cairkan larutan pencuci 20×pekat dengan air ternyahion dalam nisbah isipadu 1:19, yang akan digunakan untuk mencuci pinggan.Larutan cair ini boleh dipelihara selama 1 bulan pada 4 ℃.

1. 8.Persediaan Contoh

8.1Notis dan langkah berjaga-jaga sebelum operasi:

a) Sila gunakan petua sekali sahaja dalam eksperimen, dan tukar petua apabila menyerap reagen yang berbeza.

b) Pastikan semua instrumen eksperimen bersih.

c) reagen terbitan boleh dipelihara pada 2-8 ℃ selama tiga bulan;

d) Larutan HCl boleh dipelihara pada suhu bilik selama 3 bulan;

e) Larutan NaOH boleh dipelihara selama 3 bulan pada suhu bilik;

f) Simpan sampel yang tidak dirawat dalam keadaan beku (-20 ℃);

g) Sampel yang dirawat boleh dipelihara selama 24 jam pada 2-8 ℃ dalam kegelapan .

8.2 Sampel tisu haiwan dan hati:

----Homogenkan sampel dengan homogenizer;

----Berat 1.0±0.05g sampel tisu dihomogenkan ke dalam tiub empar polistirena 50ml.Tambah 4ml air ternyahion, 0.5ml larutan HCl 1M dan 100ul reagen terbitan (lihat larutan 1).Goncangkannya selama 2 minit.

---- Inkubasi pada 37 ℃ semalaman (kira-kira 16j);

---- Tambah 5ml 0.1MK₂HPO₄ (penyelesaian2), 0.4ml 1M NaOH (penyelesaian4) dan 5ml etil asetat.Goncang kuat selama 30s;

---- Centrifuge pada suhu bilik (20-25 ℃) selama 10 minit, sekurang-kurangnya 3000g;

---- Ambil 2.5ml fasa organik supernatan ke dalam tiub kaca bersih 10ml, kering dengan gas nitrogen 50-60℃ atau penyejat berputar;

---- Larutkan sisa kering dengan 1ml n-heksana (atau n-heptana), vorteks selama 30s, tambah 1ml larutan perahan (penyelesaian5), vorteks 1min, campurkan sepenuhnya.

---- Empar pada suhu bilik (20-25^oC) selama 5 minit, sekurang-kurangnya 3000g;

---- Keluarkan fasa organik supernatan;ambil 50μl fasa air substrat untuk ujian.

8.4 Madu

----berat 1.0±0.05g sampel madu dihomogenkan ke dalam tiub empar polistirena 50ml;

----Tambahkan 4ml air ternyahion, 0.5ml 1M HCl (penyelesaian3) dan 100μl reagen terbitan (penyelesaian1);goncang sepenuhnya selama 2 minit;

---- Inkubasi pada 37 ℃ semalaman (kira-kira 16j);

----Tambah 5ml 0.1MK₂HPO₄ (penyelesaian2), 0.4ml 1M NaOH (penyelesaian4) dan 5ml etil asetat, goncang dengan kuat selama 30s;

---- Centrifuge pada suhu bilik (20-25 ℃) selama 10 minit, sekurang-kurangnya 3000g;

----Ambil 2.5ml fasa organik supernatan ke dalam tiub kaca bersih 10ml, kering dengan gas nitrogen 50-60℃ atau penyejat berputar;

----Larutkan sisa kering dengan 1ml n-heksana (atau n-heptana), vorteks selama 30s, tambah 1ml larutan perahan (penyelesaian5), vorteks 1min, campurkan sepenuhnya.

----Empar pada suhu bilik (20-25^oC) selama 10 minit, sekurang-kurangnya 3000g;

----Alih keluar fasa organik supernatan;ambil 50μl fasa air substrat untuk ujian.

1. 9.Proses ujian

9.1Perhatikan sebelum ujian

9.1.1 Pastikan semua reagen dan perigi mikro semuanya pada suhu bilik (20-25℃).

9.1.2 Kembalikan semua reagen selebihnya kepada 2-8 ℃ sejurus selepas digunakan.

9.1.3 Mencuci perigi mikro dengan betul merupakan langkah penting dalam proses ujian;ia adalah faktor penting kepada kebolehulangan analisis ELISA.

9.1.4 Elakkan cahaya dan tutup perigi mikro semasa pengeraman.

9.2 Langkah-langkah Pengujian

9.2.1 Keluarkan semua reagen pada suhu bilik (20-25 ℃) selama lebih daripada 30 minit, homogenkan sebelum digunakan.

9.2.2 Keluarkan perigi mikro yang diperlukan dan kembalikan selebihnya ke dalam beg kunci zip pada suhu 2-8 ℃ serta-merta.

9.2.3 Larutan pencuci pekat dan larutan perahan pekat hendaklah dipanaskan semula pada suhu bilik sebelum digunakan.

9.2.4Nombor:Dinomborkan setiap kedudukan microwell dan semua piawaian dan sampel hendaklah dijalankan dalam pendua.Catatkan kedudukan piawai dan sampel.

9.2.5Pencairan larutan antibodi pekat: cairkan larutan enzim pekat dengan pelarut konjugat enzim dalam nisbah isipadu 1:10(1 kali ganda larutan enzim pekat: 10 kali ganda pelarut konjugat enzim).

9.2.6Tambah larutan piawai / sampel dan larutan konjugat enzim: tambahkan 50µl larutan standard atau sampel yang disediakan ke dalam telaga yang sepadan, tambahkan larutan konjugat enzim 50µl.Campurkan perlahan-lahan dengan menggoncang pinggan secara manual dan mengeram selama 30 minit pada 25 ℃ dengan penutup.

9.2.7Basuh: Tanggalkan penutup perlahan-lahan dan tuangkan cecair keluar dari telaga dan bilas telaga mikro dengan larutan pencuci cair 250µl (penyelesaian6) pada selang 10s selama 4-5 kali.Serap sisa air dengan kertas penyerap (selebihnya gelembung udara boleh disingkirkan dengan hujung yang tidak digunakan).

9.2.8Mewarna: Tambah 50µl larutan substrat A dan 50ul larutan substrat B pada setiap telaga.Campurkan perlahan-lahan dengan menggoyangkan pinggan secara manual dan mengeram selama 15 minit pada suhu 25 ℃ dengan penutup (lihat 12.8).

9.2.11ukur: Tambahkan 50µl larutan henti pada setiap perigi.Campurkan perlahan-lahan dengan menggoyangkan plat secara manual dan ukur penyerapan pada 450nm (Ia mencadangkan ukuran dengan dwi-panjang gelombang 450/630nm. Baca keputusan dalam masa 5 minit selepas penambahan larutan henti.)

10 Keputusan

10.1Peratusan penyerapan

Nilai min nilai penyerapan yang diperolehi untuk piawaian dan sampel dibahagikan dengan nilai penyerapan piawai pertama (standard sifar) dan didarab dengan 100%.Oleh itu, piawai sifar dibuat bersamaan dengan 100% dan nilai penyerapan disebut dalam peratusan.

=

B ——standard penyerapan (atau sampel)

B0 ——standard sifar penyerapan

10.2Keluk Piawai

----Untuk melukis lengkung piawai: Ambil nilai penyerapan piawai sebagai paksi-y, separa logaritma kepekatan larutan piawai AOZ (ppb) sebagai paksi-x.

----Kepekatan AOZ bagi setiap sampel (ppb), yang boleh dibaca daripada lengkung penentukuran, didarab dengan faktor pencairan yang sepadan bagi setiap sampel yang diikuti, dan kepekatan sebenar sampel diperolehi.

Sila ambil perhatian:

Perisian khas telah dibangunkan untuk semua pengurangan data, yang boleh disediakan atas permintaan.

Faktor pencairan……………………………………………..……2

10.Sensitiviti, ketepatan dan ketepatan

Sensitiviti: 0.025ppb

Had pengesanan:

Tisu (otot, hati)………………………………0.1ppb

Madu------------------------------------------------ -0.1ppb

Ketepatan:

Tisu haiwan (otot dan hati)…………………………100±20%

Madu………………………………..…………………… 100±20%

Ketepatan:CV kit ELISA adalah kurang daripada 10%.

11.Notis

12.1 Nilai min nilai penyerapan yang diperoleh untuk piawaian dan sampel akan dikurangkan jika reagen dan sampel tidak dikawal pada suhu bilik ( 20-25 ℃).

12.2 Jangan biarkan perigi mikro kering di antara langkah-langkah untuk mengelakkan kebolehulangan yang tidak berjaya dan kendalikan langkah seterusnya serta-merta selepas mengetuk pemegang perigi mikro.

12.3 Goncang setiap reagen perlahan-lahan sebelum digunakan.

12.4 Jauhkan kulit anda daripada larutan henti kerana ia adalah 0.5MH₂SO₄penyelesaian.

12.5 Jangan gunakan kit yang sudah lapuk.Jangan tukar reagen kumpulan yang berbeza, jika tidak, ia akan menurunkan sensitiviti.

12.6 Keadaan penyimpanan: Pastikan kit ELISA pada 2-8 ℃, jangan beku.Kedap plat microwell rehat, Elakkan cahaya matahari lurus semasa semua pengeraman.Meliputi plat mikrotiter adalah disyorkan.

12.7 Larutan substrat hendaklah ditinggalkan jika ia bertukar warna.Reagen mungkin merosot jika nilai penyerapan (450/630nm) piawai sifar adalah kurang daripada 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Tindak balas pewarnaan memerlukan 15 minit selepas penambahan larutan substrat;Anda boleh memanjangkan masa pengeraman kepada 20min atau lebih jika warnanya terlalu terang untuk ditentukan., jangan melebihi 25min. Sebaliknya, pendekkan masa pengeraman dengan betul.

12.9 Suhu tindak balas optimum ialah 25 ℃.Suhu yang lebih tinggi atau lebih rendah akan membawa kepada perubahan nilai sensitiviti dan penyerapan.

12.Keadaan penyimpanan dan tempoh penyimpanan

Keadaan penyimpanan: 2-8 ℃.

Tempoh penyimpanan: 12 bulan.