Komplet za konkurenčni encimski imunski test za kvantitativno analizo metabolita furazolidona (AOZ)
- 1.Ozadje
Nitrofurani so sintetični antibiotiki širokega spektra, ki se zaradi svojih odličnih antibakterijskih in farmakokinetičnih lastnosti pogosto uporabljajo v živinoreji.Uporabljali so jih tudi kot pospeševalce rasti pri prašičereji, perutnini in vodni proizvodnji.Dolgotrajne študije na laboratorijskih živalih so pokazale, da so matična zdravila in njihovi metaboliti pokazali rakotvorne in mutagene lastnosti.To je vodilo do prepovedi nitrofuranov za zdravljenje živali, ki se uporabljajo za proizvodnjo hrane.Nitrofuranska zdravila furaltadon, nitrofurantoin in nitrofurazon so bila v EU prepovedana za uporabo v živinoreji leta 1993, uporaba furazolidona pa je bila prepovedana leta 1995.
Analiza ostankov nitrofuranskih zdravil mora temeljiti na odkrivanju tkivno vezanih metabolitov matičnih nitrofuranskih zdravil.Ker se matična zdravila zelo hitro presnavljajo in se presnovki nitrofurana, vezani na tkivo, ohranijo dolgo časa, se ti presnovki uporabljajo kot tarča pri odkrivanju zlorabe nitrofuranov, ki vključujejo metabolit furazolidon (AOZ), metabolit furaltadona (AMOZ). ), metabolit nitrofurantoina (AHD) in metabolit nitrofurazona (SEM).
AOZ-ostanke najpogosteje določamo z LC-MS ali LC-MS/MS.Encimski imunski testi v primerjavi s kromatografskimi metodami kažejo precejšnje prednosti glede občutljivosti, meje detekcije, tehnične opreme in časovne zahteve.(časovni stroški: 45 min)
- 2.Testno načelo
Ta komplet ELISA je zasnovan za odkrivanje AOZ na podlagi principa indirektnega kompetitivnega encimskega imunskega testa.Mikrotitrske vdolbinice so prekrite z antigenom, vezanim na BSA.AOZ v vzorcu tekmuje z antigenom, prevlečenim na mikrotitrski plošči, za dodano protitelo.Po dodatku encimskega konjugata uporabimo kromogeni substrat in signal izmerimo s spektrofotometrom.Absorpcija je obratno sorazmerna s koncentracijo AOZ v vzorcu.
- 3.Aplikacije
Ta komplet se lahko uporablja pri kvantitativni in kvalitativni analizi ostankov AOZ vživalska tkiva(mišice, jetra itd.), med.
- 4.Navzkrižne reakcije
Metabolit furazolidona (AOZ)……………………..100 %
Metabolit furaltadona (AMOZ)……………………<0,1 %
Metabolit nitrofurantoina (AHD)……………………<0,1 %
Metabolit nitrofurazona (SEM)…………………...<0,1 %
Furazolidon……………………………………….…..…16,3%
Furaltadon…………………………………………….…<1 %
Nitrofurantoin……………………………………….…….…<1 %
Nitrofurazon…………………………………………..…<1%
- 5.Potrebni materiali
5.1Oprema
---- Spektrofotometer za mikrotitrsko ploščo (450nm/630nm)
---- Rotacijski uparjalnik ali instrumenti za sušenje z dušikom
---- Homogenizator / želodec
----Shaker
----Vortex mešalnik
----centrifuga
---- Analitična tehtnica (induktivnost: 0,01 g)
---- Graduirana pipeta: 10 ml
---- Gumijasta pipeta
---- Merilna bučka: 100 ml
---- Steklena bučka: 10 ml
---- Polistirenska centrifugalna epruveta: 2 ml, 50 ml
----Mikropipete: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250 ul-multipipeta
5.2Reagenti
---- Etil acetat (AR)
----n-heksan (ali n-heptan) (AR)
----Dikalijev hidrogenfosfat trihidrat
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Koncentrirana klorovodikova kislina (HCl, AR)
-----metanol
---- Natrijev hidroksid (NaOH, AR)
----Deionizirana voda
- 6.Komponente kompleta
l Mikrotiterska plošča, prevlečena z antigenom, 96 vdolbinic
l Standardne raztopine (6 steklenic, 1 ml/steklenico)
0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb
l Standardna kontrola z dodajanjem: (1 ml/stekleničko)......….100 ppb
l Koncentrirani encimski konjugat 1 ml.......rdeča kapica
l Razredčila za encimski konjugat 10 ml………..zelena kapica
l Substrat A 7 ml………............................…....…..…..bela kapica
l Substrat B 7ml………............................………….…..rdeči pokrovček
l Stop raztopina 7 ml……………………………rumena kapica
l 20×koncentrirana raztopina za pranje 40 ml
…………………………………….……prozoren pokrovček
l 2×koncentrirana ekstrakcijska raztopina 60ml….modri pokrovček
l 2-nitrobenzaldehid 15,1 mg………………bela kapica
- 7.Priprava reagentov
rešitev 1: derivat reagenta:
Dodajte 10 ml metanola v steklenico z 2-nitrobenzaldehidom in raztopite.(pri koncentraciji 10 mM).
rešitev 2: 0,1MK2HPO4rešitev:
Teža 22,8g K2HPO4.3H2O do 1 L deionizirane vode za raztapljanje.
rešitev 3: 1M raztopina HCl
Raztopite 8,3 ml koncentrirane klorovodikove kisline z deionizirano vodo do 100 ml.
Rešitev 4:1 M raztopina NaOH
Raztopite 4 g NaOH s 100 ml deionizirane vode.
Rešitev 5: ekstrakcijska raztopina:
2× koncentrirano ekstrakcijsko raztopino razredčimo z deionizirano vodo v volumskem razmerju 1:1.To raztopino lahko shranite 1 mesec pri 4 ℃, ki bo uporabljena za ekstrahiranje vzorcev.
rešitev 6: raztopina za pranje:
20× koncentrirano izpiralno raztopino razredčimo z deionizirano vodo v volumskem razmerju 1:19, ki jo bomo uporabili za izpiranje plošč.To razredčeno raztopino lahko shranite 1 mesec pri 4 ℃.
- 8.Priprave vzorcev
8.1Opomba in previdnostni ukrepi pred operacijo:
a) Pri poskusu uporabite enkratne konice in jih zamenjajte, ko absorbirate različen reagent.
b) Prepričajte se, da so vsi eksperimentalni instrumenti čisti.
c) derivatni reagent se lahko hrani pri 2-8 ℃ tri mesece;
d) Raztopino HCl lahko hranimo pri sobni temperaturi 3 mesece;
e) Raztopino NaOH lahko hranite 3 mesece pri sobni temperaturi;
f) neobdelane vzorce hranite v zamrzovalniku (-20 ℃);
g) Obdelane vzorce lahko shranite 24 ur pri 2-8 ℃ v temi.
8.2 Vzorci živalskega tkiva in jeter:
----Homogenizirajte vzorce s homogenizatorjem;
---- Natehtajte 1,0±0,05 g vzorca homogeniziranega tkiva v 50 ml polistirensko epruveto za centrifugo.Dodajte 4 ml deionizirane vode, 0,5 ml 1 M raztopine HCl in 100 ul derivata reagenta (glejte raztopino 1).Stresite 2 minuti.
---- Inkubirajte pri 37 ℃ čez noč (približno 16 ur);
---- Dodajte 5 ml 0,1 MK2HPO4 (rešitev2), 0,4 ml 1 M NaOH (rešitev4) in 5 ml etil acetata.Močno stresajte 30 s;
---- Centrifugirajte pri sobni temperaturi (20-25 ℃) 10 minut, vsaj 3000 g;
---- Vzemite 2,5 ml supernatantne organske faze v 10 ml čisto stekleno epruveto, posušite z dušikovim plinom 50-60 ℃ ali rotacijskim uparjalnikom;
---- Suhi ostanek raztopite z 1 ml n-heksana (ali n-heptana), vrtinčite 30 s, dodajte 1 ml ekstrakcijske raztopine (rešitev5), vrtinčimo 1 minuto, popolnoma premešamo.
---- Centrifugirajte pri sobni temperaturi (20-25oC) za 5 minut, vsaj 3000 g;
---- Odstranite supernatantno organsko fazo;za analizo vzemite 50 μl vodne faze substrata.
8.4 Med
---- odtehtajte 1,0±0,05 g homogeniziranega vzorca medu v 50 ml polistirensko centrifugalno epruveto;
---- Dodajte 4 ml deionizirane vode, 0,5 ml 1 M HCl (rešitev3) in 100 μl derivat reagenta (rešitev1);popolnoma stresajte 2 minuti;
---- Inkubirati pri 37 ℃ čez noč (približno 16 ur);
----Dodaj 5ml 0,1MK2HPO4 (rešitev2), 0,4 ml 1 M NaOH (rešitev4) in 5 ml etil acetata, močno stresajte 30 s;
----Centrifugirajte pri sobni temperaturi (20-25 ℃) 10 minut, vsaj 3000 g;
---- Vzemite 2,5 ml supernatantne organske faze v 10 ml čisto stekleno epruveto, posušite z dušikovim plinom pri 50–60 ℃ ali rotacijskim uparjalnikom;
---- Suhi ostanek raztopite z 1 ml n-heksana (ali n-heptana), vrtinčite 30 s, dodajte 1 ml ekstrakcijske raztopine (rešitev5), vrtinčimo 1 minuto, popolnoma premešamo.
----Centrifugirajte pri sobni temperaturi (20-25oC) za 10 minut, vsaj 3000 g;
----Odstranite organsko fazo supernatanta;za analizo vzemite 50 μl vodne faze substrata.
- 9.Postopek testiranja
9.1Opozorilo pred analizo
9.1.1 Prepričajte se, da so vsi reagenti in mikrovdolbinice na sobni temperaturi (20–25 ℃).
9.1.2 Vse preostale reagente takoj po uporabi vrnite na 2-8 ℃.
9.1.3 Pravilno pranje mikrovdolbinic je pomemben korak v procesu analize;je ključni dejavnik za ponovljivost analize ELISA.
9.1.4 Med inkubacijo se izogibajte svetlobi in pokrijte mikrovdolbinice.
9.2 Koraki preizkusa
9.2.1 Vse reagente vzemite ven pri sobni temperaturi (20-25 ℃) za več kot 30 minut, pred uporabo jih homogenizirajte.
9.2.2 Vzemite potrebne mikrovdolbinice in takoj vrnite preostanek v vrečko z zadrgo pri 2–8 ℃.
9.2.3 Koncentrirano raztopino za izpiranje in koncentrirano raztopino za ekstrakcijo je treba pred uporabo ponovno segreti na sobno temperaturo.
9.2.4številka:Oštevilčite vse položaje mikrovdolbinic in vse standarde ter vzorce je treba izvesti v dvojniku.Zabeležite položaje standardov in vzorcev.
9.2.5Redčenje koncentrirane raztopine protiteles: razredčite koncentrirano raztopino encima z razredčili encimskega konjugata v volumskem razmerju 1:10 (1-kratna koncentrirana raztopina encima: 10-kratna razredčila encimskega konjugata).
9.2.6Dodajte standardno raztopino/vzorec in raztopino encimskega konjugata: dodajte 50 µl standardne raztopine ali pripravljenega vzorca v ustrezne vdolbinice, dodajte 50 µl raztopine encimskega konjugata.Nežno premešajte z ročnim stresanjem plošče in inkubirajte 30 minut pri 25 ℃ s pokrovom.
9.2.7Operite: Nežno odstranite pokrov in izlijte tekočino iz vdolbinic ter izperite mikrovdolbinice z 250 µl razredčene raztopine za izpiranje (rešitev6) v intervalu 10 s 4-5 krat.Preostalo vodo popivnajte z vpojnim papirjem (ostali zračni mehurček lahko odstranite z neuporabljeno konico).
9.2.8Obarvanost: Dodajte 50 µl raztopine substrata A in 50 µl raztopine substrata B v vsako vdolbinico.Nežno premešajte z ročnim zibanjem plošče in inkubirajte 15 minut pri 25 °C s pokrovom (glejte 12.8).
9.2.11Izmeri: Dodajte 50 µl stop raztopine v vsako vdolbinico.Nežno premešajte z ročnim zibanjem plošče in izmerite absorbanco pri 450 nm (Predlagano je merjenje z dvojno valovno dolžino 450/630 nm. Odčitajte rezultat v 5 minutah po dodatku stop raztopine. )
10 Rezultati
10.1Odstotek absorbance
Srednje vrednosti vrednosti absorbance, dobljene za standarde in vzorce, se delijo z vrednostjo absorbance prvega standarda (ničelni standard) in pomnožijo s 100 %.Ničelni standard je tako enak 100 %, vrednosti absorbance pa so navedene v odstotkih.
=
B ——standard absorpcije (ali vzorec)
B0 ——standard absorpcije nič
10.2Standardna krivulja
----Za risanje standardne krivulje: Vzemite vrednost absorbance standardov kot os y, pollogaritemsko koncentracijo standardne raztopine AOZ (ppb) kot os x.
---- Koncentracija AOZ vsakega vzorca (ppb), ki jo je mogoče prebrati iz umeritvene krivulje, se pomnoži z ustreznim faktorjem redčenja vsakega vzorca, ki mu sledi, in dobi se dejanska koncentracija vzorca.
Upoštevajte:
Za vso redukcijo podatkov je bila razvita posebna programska oprema, ki je na voljo na zahtevo.
Faktor redčenja………………………………………..……2
10.Občutljivost, točnost in natančnost
Občutljivost: 0,025 ppb
Meja zaznavanja:
Tkivo (mišice, jetra)…………………………0,1ppb
Med ------------------------------------------------- -0,1 ppb
Natančnost:
Živalsko tkivo (mišice in jetra)…………………100±20%
Med…………………………………..………….... 100±20%
Natančnost:CV kompleta ELISA je manj kot 10 %.
11.Opaziti
12.1 Srednje vrednosti vrednosti absorbance, dobljene za standarde in vzorce, bodo zmanjšane, če reagenti in vzorci niso bili naravnani na sobno temperaturo (20-25 ℃).
12.2 Ne dovolite, da se mikrovdolbinice posušijo med koraki, da preprečite neuspešno ponovljivost, in zaženite naslednji korak takoj po dotiku držala mikrovdolbinic.
12.3 Vsak reagent pred uporabo nežno pretresite.
12.4 Kožo ne približujte stop raztopini, ker je 0,5MH2SO4rešitev.
12.5 Ne uporabljajte zastarelih kompletov.Ne zamenjujte reagentov iz različnih serij, sicer bo padla občutljivost.
12.6 Pogoji shranjevanja: Komplete ELISA shranjujte pri 2-8 ℃, ne zamrzujte.Zaprite plošče z mikrovdolbinicami, med vsemi inkubacijami se izogibajte neposredni sončni svetlobi.Priporočljivo je, da mikrotitrske plošče pokrijete.
12.7 Raztopino substrata je treba opustiti, če se obarva.Reagenti se lahko poslabšajo, če je vrednost absorbance (450/630 nm) ničelnega standarda manjša od 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 Barvna reakcija traja 15 minut po dodajanju raztopine substrata;Čas inkubacije lahko podaljšate na 20 minut ali več, če je barva presvetla, da bi jo bilo mogoče določiti. Nikoli ne presezite 25 minut. Nasprotno, čas inkubacije ustrezno skrajšajte.
12.9 Optimalna reakcijska temperatura je 25 ℃.Višja ali nižja temperatura bo povzročila spremembe vrednosti občutljivosti in absorbance.
12.Pogoji skladiščenja in obdobje skladiščenja
Pogoji shranjevanja: 2-8 ℃.
Rok skladiščenja: 12 mesecev.
